| Purification of RNA Mango Tagged Native RNA-protein Complexes from Cellular Extracts Using TO1-Desthiobiotin Fluorophore Ligand
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] A native purification strategy using RNA Mango for RNA based purification of RNA-protein complexes is described. The RNA Mango aptamer is first genetically engineered into the RNA of interest. RNA Mango containing complexes obtained from cleared cellular native extracts are then immobilized onto TO1-Desthiobiotin saturated streptavidin agarose beads. The beads are washed to remove non-specific complexes and then the RNA Mango containing complexes are eluted by the addition of free biotin to the beads. Since the eluted complexes are native and fluorescent, a second purification step such as ...
[摘要] 描述了使用RNA Mango进行RNA-蛋白质复合物的RNA纯化的天然纯化策略。 RNA芒果适体首先被基因工程改造成感兴趣的RNA。 然后将从清除的细胞天然提取物获得的含有RNA复合物的复合物固定在TO1-Desthiobiotin饱和的链霉亲和素琼脂糖珠上。 洗涤珠粒以去除非特异性复合物，然后通过向珠粒中加入游离生物素来洗脱含RNA芒果的复合物。 由于洗脱的复合物是天然的和荧光的，所以可以容易地添加第二纯化步骤如尺寸排阻色谱，并且通过监测荧光追踪纯化的复合物。 通过这种两步纯化策略产生的高纯度天然复合物可以用于进一步的生物化学表征。
【背景】目前的RNA标签受限于诸如差K ，大尺寸，潜在的生物学干扰或缺乏固有荧光的限制（Panchapakesan等人， 2015年）。 RNA芒果很小，可以简单地整合到茎环结构中，特别是GNRA tetraloops中，它具有生物耐受性，并且最重要的是对其噻唑橙基（TO1）配体TO1-Desthiobiotin（TO1-Dtb）具有高亲和力。 ...
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| Modification of 3’ Terminal Ends of DNA and RNA Using DNA Polymerase θ Terminal Transferase Activity
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] DNA polymerase θ (Polθ) is a promiscuous enzyme that is essential for the error-prone DNA double-strand break (DSB) repair pathway called alternative end-joining (alt-EJ). During this form of DSB repair, Polθ performs terminal transferase activity at the 3’ termini of resected DSBs via templated and non-templated nucleotide addition cycles. Since human Polθ is able to modify the 3’ terminal ends of both DNA and RNA with a wide array of large and diverse ribonucleotide and deoxyribonucleotide analogs, its terminal transferase activity is more useful for biotechnology applications than terminal ...
[摘要] DNA聚合酶θ（Polθ）是一种混杂的酶，对易错的DNA双链断裂（DSB）修复途径而言是必需的，称为替代性末端连接（alt-EJ）。 在这种形式的DSB修复中，Polθ通过模板和非模板核苷酸添加循环在切割的DSB的3'末端处进行末端转移酶活性。 由于人Polθ能够用广泛的多种核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸类似物修饰DNA和RNA的3'末端，因此其末端转移酶活性对于生物技术应用比末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）更有用。 在这里，我们详细介绍使用纯化的人Polθ修饰生物技术和生物医学研究中各种应用的RNA和DNA的3'末端的简单方法。
【背景】人类POLQ基因编码含有N末端超家族2（SF2）型解旋酶结构域和C末端A家族聚合酶结构域的大蛋白质（Sfeir和Symington，2015; Black et al。，2016; Wood and Doublie， 2016）。蛋白质也编码一个大的中心结构域，其功能尚未归入。 Polθ在后生动物中表达，已被证明在DNA复制和修复的多个方面起作用（Black et al。，2016; Wood and Doublie，2016）。最近的工作表明，哺乳动物Polθ对于易于识别的DNA双链断裂（DSB）修复途径而言是必需的，称为替代性末端连接（alt-EJ），也称微小鼠介导的终结合（MMEJ）（Yousefzadeh et al。 ，2014; ...
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