| cDNA Display Mediated Immuno-PCR (cD-IPCR): A Novel PCR-based Antigen Detection Method
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Author:
Date:
2019-12-20
[Abstract] Immuno-PCR (IPCR) is a powerful method in antigen detection where a PCR-amplifiable DNA reporter is conjugated to a specific antibody or an aptamer for the target molecule. In the development and application of IPCR, successful conjugation of a protein (an antibody) with a reporter DNA becomes challenging. To address this issue, we recently demonstrated the feasibility of IPCR based on cDNA display, a 1:1 covalent complex of a polypeptide and its encoding cDNA at the single molecule level. The cDNA display molecule for IPCR is generated first by transcribing the DNA that encodes the detection ...
[摘要] 免疫PCR（IPCR）是抗原检测中的一种强大方法，其中可PCR扩增的DNA报道分子与目标分子的特异性抗体或适体偶联。在IPCR的开发和应用中，蛋白质（抗体）与报告DNA的成功偶联变得具有挑战性。为了解决这个问题，我们最近证明了基于cDNA展示，多肽的1：1共价复合物及其单分子编码cDNA的IPCR的可行性。首先，通过体外转录将编码检测抗体的DNA转录为mRNA，从而生成用于IPCR的cDNA展示分子。然后将嘌呤霉素DNA接头连接到mRNA，然后进行体外翻译和逆转录生成cDNA展示分子。然后将该分子直接用于抗原检测和后续qPCR。如果已知其单结构域抗体（VHH）或肽适体的序列，则该方法可用于检测生物样品中的各种抗原。
【背景】免疫-PCR，通常缩写为IPCR，是一种检测和定量生物样品（例如，血清和尿液）中存在的低丰度生物标志物的强大方法。它充当免疫反应和信号放大之间的桥梁。在大多数情况下，IPCR依赖于已与报道寡核苷酸偶联的检测抗体的使用，然后使用报道者的实时PCR定量分析物（Sano et al。， 1992）。然而，在IPCR的开发和应用中，与寡核苷酸适当结合抗体的困难已经成为最具挑战性的问题（van ...
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| Measuring Nucleosome Assembly Activity in vitro with the Nucleosome Assembly and Quantification (NAQ) Assay
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] Nucleosomes organize the eukaryotic genome into chromatin. In cells, nucleosome assembly relies on the activity of histone chaperones, proteins with high binding affinity to histones. At least a subset of histone chaperones promotes histone deposition in vivo. However, it has been challenging to characterize this activity, due to the lack of quantitative assays.
Here we developed a quantitative nucleosome assembly (NAQ) assay to measure the amount of nucleosome formation in vitro. This assay relies on a Micrococcal nuclease (MNase) digestion step that yields ...
[摘要] 核小体将真核生物基因组组装成染色质。在细胞中，核小体装配依赖于组蛋白分子伴侣的活性，对组蛋白具有高结合亲和力的蛋白。至少有一部分组蛋白伴侣促进组蛋白在体内的沉积。然而，由于缺乏定量分析，鉴定这种活性一直是一个挑战。
在这里，我们开发了一种定量核小体装配（NAQ）测定来测量体外核小体形成的量。该测定依赖于微球菌核酸酶（MNase）。随后在生物分析仪上运行，可以准确量化相对于加样对照的片段（长度和数量）。这使我们能够测量约150bp的DNA长度。该测定最终实现了不同组蛋白分子伴侣的核小体装配活性的表征，这是理解这些蛋白体内功能作用的一个步骤。
【背景】真核生物基因组被组织成核小体。核小体是由组蛋白八聚体核心组成的模块化和动态结构，由147bp的DNA包裹（Luger等人，1997）。核小体组装始于一个（H3-H4）2四聚体沉积到DNA上以形成四体体。随后的H2A-H2B二聚体结合形成六聚体，最后形成核小体。组蛋白高度带电，因为它们以生理盐浓度存在于组蛋白二聚体中。由于它们的作用，组蛋白需要分子伴侣将它们从细胞质穿梭到细胞核，然后辅助它们沉积到DNA上或从DNA上去除（Gurard-Levin等人，2014）。
组蛋白分子伴侣分组在结构上不相关的蛋白质家族中，所有这些蛋白质的特征在于对组蛋白的高度结合亲和力（Laskey等，1978）。通过这种方式，他们屏蔽了组蛋白的电荷，阻止了与DNA和其他细胞因子的非特异性相互作用（Elsässerand ...
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| In vitro Assay to Measure DNA Polymerase β Nucleotide Insertion Coupled with the DNA Ligation Reaction during Base Excision Repair
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] We previously reported that oxidized nucleotide insertion by DNA polymerase β (pol β) can confound the DNA ligation step during base excision repair (BER) (Çağlayan et al., 2017). Here, we describe a method to investigate pol β nucleotide insertion coupled with DNA ligation, in the same reaction mixture including dGTP or 8-oxo-dGTP, pol β and DNA ligase I. This in vitro assay enables us to measure the products for correct vs. oxidized nucleotide insertion, DNA ligation, and ligation failure, i.e., abortive ligation products, as a function of reaction time. This ...
[摘要] 我们以前报告说，通过DNA聚合酶β（polβ）的氧化的核苷酸插入可能会在碱基切除修复（BER）（Çağlayan等，2017）期间混淆DNA连接步骤。 在这里，我们描述了在与dGTP或8-氧代-dGTP，polβ和DNA连接酶I相同的反应混合物中研究与DNA连接相结合的polβ核苷酸插入的方法。该体外测定使得我们能够测量产物的正确性 与氧化核苷酸插入，DNA连接和连接失败，即流产结扎产物，作为反应时间的函数。 该协议补充了我们以前的出版物，并描述了一种有效的方法来分析BER酶的活性和polβ和DNA连接酶I在体外的功能相互作用。
【背景】该方案是观察BER路径的最后两个步骤：通过连接酶I通过polβ进行核苷酸插入和DNA连接。使用该方案，在体外在同一反应混合物中测量两种反应作为时间的函数。原始实体是在模拟BER中间体的单核苷酸缺口DNA底物上分析BER酶polβ和DNA连接酶I。这些BER酶与此BER中间体结合并起作用。该方案中使用的DNA底物包括在5'和3'端的荧光标记，使我们能够观察DNA底物的单核苷酸插入和DNA连接。与DNA连接偶联的polβ核苷酸插入模拟了切口DNA中间体从核苷酸插入步骤切换或引导到BER途径期间的连接步骤。使用该方案，也可以在polβ氧化的核苷酸（8-氧代-dGTP）插入后测量连接失败或者终止连接。这通过在BER中间体的5'-末端添加腺苷酸（AMP）基团进行定量来实现。该方案也可用于测量与其他DNA聚合酶和DNA连接酶连接的核苷酸插入。 ...
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