| Protocol for Establishing a Multiplex Image-based Autophagy RNAi Screen in Cell Cultures
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] Autophagy is a recycling pathway, in which intracellular cargoes including protein aggregates and bacteria are engulfed by autophagosomes and subsequently degraded after fusion with lysosomes. Dysregulation of this process is involved in several human diseases such as cancer or neurodegeneration. Hence, advancing our understanding of how autophagy is regulated provides an opportunity to explore druggable targets and subsequently develop treatment strategies for these diseases. To identify novel autophagy regulators, we developed an image-based phenotypic RNAi screening approach using ...
[摘要] 自噬是一种循环途径，其中细胞内货物包括蛋白质聚集体和细菌被自噬吞噬，随后与溶酶体融合后降解。这种过程的失调涉及几种人类疾病，如癌症或神经退行性疾病。因此，提高我们对自噬如何监管的理解提供了探索可药用靶标的机会，并随后制定了这些疾病的治疗策略。为了鉴定新的自噬调节因子，我们开发了一种基于图像的表型RNAi筛选方法，在内源水平上使用自噬标记蛋白（Jung et al。，2017）。与以前进行的自噬屏幕相比，该方法不使用过表达标记的自噬标记蛋白，而是在内源水平检测自噬结构。此外，我们同时监测自噬的早期和晚期阶段，而其他筛选仅使用单个自噬体标志物大多为GFP-LC3B。在这里，我们详细描述了这种多重筛选方案，并讨论了如何建立基于图像的siRNA筛选的一般考虑。
【背景】自噬是一种细胞内质量和数量控制途径，通过这种途径，多种细胞溶质材料如病原体，细胞器或其部分，蛋白质和其他大分子被双重膜结构所吞噬，造成自噬体，并在自噬体与溶酶体融合后进行大量溶酶体降解。自体吞噬体的形成及其对自体溶酶体的成熟是一个高度规范的过程。在酵母中最初鉴定的AuTophaGy相关（ATG）基因是泛蛋白样蛋白Atg8，其通过与位于受体自噬体中的磷脂磷脂酰乙醇胺（PE）的可逆缀合以高度局部化的方式发挥其功能。人类细胞含有六个ATG8家族成员，可以分为两个亚科：i）微管相关蛋白1A / ...
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| Assaying Glycogen and Trehalose in Yeast
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Author:
Date:
2017-07-05
[Abstract] Organisms store carbohydrates in several forms. In yeast, carbohydrates are stored in glycogen (a multi-branched polysaccharide) and in trehalose (a disaccharide). As in other organisms, the amount of stored carbohydrate varies dramatically with physiological state, and accordingly, an assay of stored carbohydrate can help reveal physiological state. Here, we describe relatively easy and streamlined assays for glycogen and trehalose in yeast that can be applied either to a few samples, or in a moderately high-throughput fashion (dozens to hundreds of samples).
[摘要] 生物体以多种形式储存碳水化合物。 在酵母中，碳水化合物储存在糖原（多支链多糖）和海藻糖（二糖）中。 如在其他生物体中，存储的碳水化合物的量与生理状态显着变化，因此，存储的碳水化合物的测定可以帮助揭示生理状态。 在这里，我们描述了酵母中糖原和海藻糖的相对容易和流线型的测定法，其可以应用于少量样品，或以适度高通量的方式（几十至几百个样品）。
【背景】糖原和海藻糖是酵母和许多其他生物的两种储存碳水化合物。在酵母中，当培养基开始耗尽并且细胞生长速率降低时，这两种储存碳水化合物都会积累。测定酵母中存储碳水化合物的方法可追溯到至少1956年（Trevelyan和Harrison，1956a和1956b），并且自（例如，Becker，1978; Quain，1981; Schulze ，1995; Parrou和Francois，1997; Plata等人，2013）等）。测定这两种储存碳水化合物有三个基本步骤：首先，裂解或渗透细胞;第二，从糖原或海藻糖释放葡萄糖;第三，测定所得葡萄糖。
细胞可以机械裂解（Schulze等人，1995），但这不可避免地有点乏味和耗时，并且往往需要更多的细胞。细胞可以被碱渗透，但是糖原形成大的多支化颗粒，并且难以提取，因此一些方案既使用碱和酸提取（Trevelyan和Harrison，1956a和1956b; ...
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