Artificial Inoculation of Epichloë festucae into Lolium perenne, and Visualisation of Endophytic and Epiphyllous Fungal Growth
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Natural hosts for the fungal endophyte Epichloë festucae include Festuca rubra (fine fescue) and Festuca trachyphylla (hard fescue). Some strains also form stable associations with Lolium perenne (perennial ryegrass). L. perenne is a suitable host to study fungal endophyte–grass interactions, such as endophytic fungal growth within the plant and epiphyllous growth on the plant surface. Here we provide a detailed protocol based on work by, for artificial inoculation of E. festucae into L. perenne, and newly developed staining and ...
[摘要] 真菌内生菌Epichloëfestucae的天然宿主包括 Festuca rubra (细羊茅)和 Festuca trachyphylla (硬羊茅)。一些菌株也与黑麦草(多年生黑麦草)形成稳定的关联。 升。 perenne 是研究真菌内生菌 - 草相互作用的合适宿主,例如植物内生真菌生长和植物表面的叶生生长。在这里,我们提供了一个基于工作的详细协议,用于 E的人工接种。 festucae 进入 L. perenne ,以及新开发的染色和可视化技术,用于观察内生和附生的菌丝和表达菌,这是一种类似真菌的结构,用于离开植物。染色方法使用葡聚糖结合苯胺蓝二铵盐(AB)和几丁质结合小麦胚凝集素缀合的Alexa Fluor ® 488-(WGA-AF488)的组合。该协议将是研究Epichloë -grass相互作用的有用工具,特别是不同Epichloë - 草关联,各种内生菌 - 宿主发育阶段的比较,以及分析突变Epichloë菌株。
【背景】Latch和Christensen(1985)开发了一种用Epichloë内生菌人工感染草的方案。这项工作一直是广泛的 E的基础。 festucae Fl1- L. perenne 共生研究(Scott et al。,2012年综述)。在我们最近的工作中,我们描述了一种新发现的真菌结构,即能够实现 E的表达式。 ...
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Ensifer-mediated Arabidopsis thaliana Root Transformation (E-ART): A Protocol to Analyse the Factors that Support Ensifer-mediated Transformation (EMT) of Plant Cells
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Date:
2017-10-05
[Abstract] Ensifer adhaerens OV14, a soil borne alpha-proteobacteria of the Rhizobiaceae family, fortifies the novel plant transformation technology platform termed ‘Ensifer-mediated transformation’ (EMT). EMT can stably transform both monocot and dicot species, and the host range of EMT is continuously expanding across a diverse range of crop species. In this protocol, we adapted a previously published account that describes the use of Arabidopsis thaliana roots to investigate the interaction of A. thaliana and Agrobacterium tumefaciens. In our laboratory, ...
[摘要] OV14;土壤传播的根瘤菌科的α-变形细菌强化了新型植物转化技术平台,称为“插入式”介导的转化(EMT)。 EMT可以稳定地转化单子叶植物和双子叶植物,并且EMT的宿主范围在不同范围的作物种类上不断扩大。在这个协议中,我们调整了一个以前发布的帐户,描述了使用拟南芥根系来研究 A的相互作用。 thaliana 和根癌土壤杆菌。在我们的实验室,我们通常使用 A。 thaliana 根外植体,以检查增强EMT效用的因素。此外,E-ART协议可用于研究E的转录反应。接种外植体组织后的寄主植物,宿主植物,不同的引物菌株/突变体的可变性以及测试A的易感性。作为破译支持EMT的机制的手段。【背景】推进“Ensifer”介导的转化(EMT)技术以成功地转化双子叶菊,即拟南芥,马铃薯Solanum tuberosum ,Nicotiana tabacum ,Manihot esculenta ,欧洲油菜和单子叶植物;之前曾报道过(Wendt等人,2012; Zuniga-Soto等人),2015; Chavarriaga-Aguirre et al。,2016; Rathore等人,2016)。另外,E的基因组分析。 (2014)发现,该细菌具有7.7Mb的基因组,其包含两条环状染色体(3.96Mb和2.01Mb)和两条质粒(1.61Mb和125Kb) )。 ...
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Generation of Targeted Knockout Mutants in Arabidopsis thaliana Using CRISPR/Cas9
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Date:
2017-07-05
[Abstract] The CRISPR/Cas9 system has emerged as a powerful tool for gene editing in plants and beyond. We have developed a plant vector system for targeted Cas9-dependent mutagenesis of genes in up to two different target sites in Arabidopsis thaliana. This protocol describes a simple 1-week cloning procedure for a single T-DNA vector containing the genes for Cas9 and sgRNAs, as well as the detection of induced mutations in planta. The procedure can likely be adapted for other transformable plant species.
[摘要] CRISPR / Cas9系统已成为植物及其以外基因编辑的强大工具。 我们已经开发了植物载体系统,用于拟南芥中多达两个不同靶位点的基因的目标Cas9依赖性诱变。 该方案描述了对于含有Cas9和sgRNA的基因的单个T-DNA载体的简单的1周克隆程序,以及植物中诱导突变的检测。 该方法可能适用于其他可转化植物物种。 【背景】CRISPR / Cas9系统(Cas9)提供了一种简单且广泛适用的方法来修改感兴趣的基因组区域,因此成为植物和其他生物体基因组编辑的首选工具(Schiml和Puchta,2016)。该系统依赖于可以通过短的人造单指导RNA分子(sgRNA)向基因组DNA序列引导的化脓性链球菌(Cas9)的细菌Cas9核酸酶(Jinek等人, ,2012),在那里它创建一个双链断裂(DSB)。然后通过植物细胞的固有DNA修复机制修复这些DSB。在这里,可以区分两个主要途径(Salomon和Puchta,1998)。 (i)与DSB位点高度同源的DNA分子可用作修复模板。可以利用这种同源性定向修复(HDR)方法在DSB的现场引入特定的序列(Schiml等人,2014; Baltes and Voytas,2015)。然而,由于这些序列的低融合率,植物中HDR介导的基因编辑仍然具有挑战性。 ...
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