pUB-Cas9

公司名称: Addgene

产品编号: 86556

Dual sgRNA-based Targeted Deletion of Large Genomic Regions and Isolation of Heritable Cas9-free Mutants in Arabidopsis

Yu Jin and Sebastian Marquardt

Published online: 2020-10-20

Bio-protocol()

Company-protocol()

Other protocol()

Generation of Targeted Knockout Mutants in Arabidopsis thaliana Using CRISPR/Cas9

Author:

Florian Hahn, Marion Eisenhut, Otho Mantegazza and Andreas P. M. Weber,

Date:

2017-07-05

[Abstract] The CRISPR/Cas9 system has emerged as a powerful tool for gene editing in plants and beyond. We have developed a plant vector system for targeted Cas9-dependent mutagenesis of genes in up to two different target sites in Arabidopsis thaliana. This protocol describes a simple 1-week cloning procedure for a single T-DNA vector containing the genes for Cas9 and sgRNAs, as well as the detection of induced mutations in planta. The procedure can likely be adapted for other transformable plant species. [摘要] CRISPR / Cas9系统已成为植物及其以外基因编辑的强大工具。我们已经开发了植物载体系统，用于拟南芥中多达两个不同靶位点的基因的目标Cas9依赖性诱变。该方案描述了对于含有Cas9和sgRNA的基因的单个T-DNA载体的简单的1周克隆程序，以及植物中诱导突变的检测。该方法可能适用于其他可转化植物物种。
【背景】CRISPR / Cas9系统（Cas9）提供了一种简单且广泛适用的方法来修改感兴趣的基因组区域，因此成为植物和其他生物体基因组编辑的首选工具（Schiml和Puchta，2016）。该系统依赖于可以通过短的人造单指导RNA分子（sgRNA）向基因组DNA序列引导的化脓性链球菌（Cas9）的细菌Cas9核酸酶（Jinek等人，，2012），在那里它创建一个双链断裂（DSB）。然后通过植物细胞的固有DNA修复机制修复这些DSB。在这里，可以区分两个主要途径（Salomon和Puchta，1998）。（i）与DSB位点高度同源的DNA分子可用作修复模板。可以利用这种同源性定向修复（HDR）方法在DSB的现场引入特定的序列（Schiml等人，2014; Baltes and Voytas，2015）。然而，由于这些序列的低融合率，植物中HDR介导的基因编辑仍然具有挑战性。 ...

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