| Affinity Purification of GO-Matryoshka Biosensors from E. coli for Quantitative Ratiometric Fluorescence Analyses
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Author:
Date:
2020-10-05
[Abstract] Genetically encoded biosensors are powerful tools for quantitative visualization of ions and metabolites in vivo. Design and optimization of such biosensors typically require analyses of large numbers of variants. Sensor properties determined in vitro such as substrate specificity, affinity, response range, dynamic range, and signal-to-noise ratio are important for evaluating in vivo data. This protocol provides a robust methodology for in vitro binding assays of newly designed sensors. Here we present a detailed protocol for purification and in vitro ...
[摘要] [摘要]遗传编码的生物传感器是强大的工具为离子和代谢物的定量可视化在体内。设计和优化此类生物传感器通常需要分析大量变体。体外确定的传感器特性，例如底物特异性，亲和力，响应范围，动态范围和信噪比，对于评估体内数据很重要。该协议为新设计的传感器的体外结合测定提供了可靠的方法。这里我们提出了一个详细的协议用于纯化和体外表征的遗传编码的传感器，例示的His亲和标记的GO-（绿橙色）MatryoshCaMP6s钙传感器。GO-Matryoshka传感器基于在感兴趣的结合蛋白内一步插入一个包含两个嵌套荧光蛋白，圆形排列的荧光绿色FP（cpGFP ）和Large Stoke Shift LSSmOrange的盒的方法，从而产生了利用被分析物触发的比例式传感器cpGFP的荧光变化。
[背景技术]将绿色荧光蛋白（GFP）在1962年被鉴定在水母水母维多利亚（下村等人，1962） 。30年后，描述了其首次用作报道基因（Chalfie等，1994）。自从发现以来，GFP变体和其他荧光蛋白为生物科学的主要进步做出了巨大贡献，并且现在已成为生物医学研究中的常用工具（Frommer等，2009）。
各种荧光蛋白（FP）和FP变异体已被用作报道分子或与所有生命王国的生物体中的蛋白融合（Chudakov等，2010 ；Valeur和Berberan- ...
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| Synthetic Genetic Interaction (CRISPR-SGI) Profiling in Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] Genetic interaction screens are a powerful methodology to establish novel roles for genes and elucidate functional connections between genes. Such studies have been performed to great effect in single-cell organisms such as yeast and E. coli (Schuldiner et al., 2005; Butland et al., 2008; Costanzo et al., 2010), but similar large-scale interaction studies using targeted reverse-genetic deletions in multi-cellular organisms have not been feasible. We developed a CRISPR/Cas9-based method for deleting genes in C. elegans and replacing them with a ...
[摘要] 遗传交互筛选是一种强有力的方法，可为基因建立新的作用并阐明基因之间的功能联系。这样的研究已经在单细胞生物如酵母和E中发挥了极大的作用。 （Schuldiner等人，2005; Butland等人，2008; Costanzo等人，2010），但是，在多细胞生物中使用靶向反向遗传缺失的类似大规模相互作用研究尚不可行。我们开发了一种基于CRISPR / Cas9的方法来删除 C中的基因。 elegans 并用异源荧光报道基因取代它们（Norris等人，2015）。最近，我们利用该系统首次在动物中使用无效等位基因进行大规模的反向遗传筛选，重点关注RNA结合蛋白基因（Norris等人，2017）。这种类型的方法应该类似地适用于 C中的许多其他基因类。线虫。在这里，我们详细介绍了生成双突变体库和执行中等通量竞争性健身测定来测试导致适应性变化的遗传相互作用的方案。
【背景】使用反向遗传无效等位基因的大规模遗传相互作用筛选在动物中以前不可行。 RNAi已被用于研究C中的遗传相互作用。通过在存在单一突变背景下敲除大量不同基因的表达（Baugh等人，2005; Lehner等人）， ，2006）。然而，这种策略受到RNAi敲低效率的限制，从而使结果的解释变得复杂。我们开发了一种用于高效编辑 C的方法。线虫基因组（Norris et ...
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| Infection of Caenorhabditis elegans with Vesicular Stomatitis Virus via Microinjection
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] Over the past 15 years, the free-living nematode, Caenorhabditis elegans has become an important model system for exploring eukaryotic innate immunity to bacterial and fungal pathogens. More recently, infection models using either natural or non-natural nematode viruses have also been established in C. elegans. These models offer new opportunities to use the nematode to understand eukaryotic antiviral defense mechanisms. Here we report protocols for the infection of C. elegans with a non-natural viral pathogen, vesicular stomatitis virus (VSV) through ...
[摘要] 在过去的15年中，线虫自由生活已经成为探索真核细菌和真菌病原体真核免疫的重要模型系统。 最近，使用天然或非天然线虫病毒的感染模型也已经在C中建立。线虫。 这些模型提供了使用线虫了解真核抗病毒防御机制的新机会。 在这里，我们报告感染的协议。 线虫与非天然病毒病原体，水泡性口炎病毒（VSV）通过显微注射。 我们还描述了编码荧光或萤光素酶报告基因的重组VSV毒株如何与简单的基于荧光，存活和发光的分析结合使用来鉴定宿主遗传背景，并对病毒感染有不同的易感性。
【背景】由于它的遗传易用性，体积小，文化价廉，透明的身体，自由生活的线虫秀丽隐杆线虫作为模式生物提供了许多优点。此外，C的易感性。线虫对人类多种细菌和真菌病原体的作用使得这种蠕虫成为研究微生物发病机制的有吸引力的系统（Zhang和Hou，2013; Cohen and Troemel，2015）。最近，发现了正义ssRNA奥赛病毒（OV）作为第一种天然的病毒病原体。线虫已经提示使用OV- C。 elegans 模型来定义线虫抗病毒防御机制（Felix等人，2011; Gammon，2017）。这些研究已经证明了线虫抗病毒RNA干扰途径组分如Dicer相关解旋酶1（DRH-1）在限制病毒复制中的明确作用（Ashe等人，2013）。
为了补充OV模型系统，我们最近报道了新一代病毒的产生。使用反义ssRNA水泡性口炎病毒（VSV）（Gammon等人，2017）的线虫模型。用VSV感染野生型（N2）蠕虫是致命的，虽然抗病毒反应（例如突变体，drh-1突变体）突变体缺陷会更快地感染感染（Gammon ...
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