| FRET-based Stoichiometry Measurements of Protein Complexes in vitro
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] For a complete understanding of biochemical reactions, information on complex stoichiometry is essential. However, measuring stoichiometry is experimentally challenging. Our lab has developed a FRET-based assay to study protein complex stoichiometry in vitro. This assay, also known as Job plot, is set up as a continuous variation of the molar ratio between the two species, kept at constant total concentration. The FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) between the two fluorescently-labeled proteins is measured and the stoichiometry is inferred from the sample with highest FRET ...
[摘要] 为了全面了解生化反应，复杂的化学计量学信息是必不可少的。 然而，测量化学计量学在实验上是具有挑战性的。 我们的实验室已经开发了基于FRET的测定法来研究蛋白质复合体化学计量体外。 该测定法也被称为作业区，其被设定为两种物质之间的摩尔比的连续变化，保持恒定的总浓度。 测量两种荧光标记蛋白之间的FRET（荧光共振能量转移），并从具有最高FRET信号的样品中推断化学计量。 这种方法使我们能够评估溶液中复杂的化学计量。
【背景】每个生物化学反应需要两种或更多种细胞组分之间的相互作用。这些相互作用的化学计量是调节细胞生物化学反应的重要因素。因此，复杂化学计量的实验确定对于充分了解细胞内工作的生物化学和生物物理学过程至关重要。
测量化学计量具有实验上的挑战性。化学计量可以通过低分辨率结构分析来推断。这些方法包括尺寸排阻色谱法，多角度光散射，分析超速离心，其能够提供粒子的精确分子量。但是，这些方法被认为是次要的。
基于FRET（荧光共振能量转移）的溶液中的化学计量。这种测定方法称为工作区（Huang，1982），可以用较少的材料进行，更适合研究任何复杂的地层，与两种成分的大小无关。在该测定中，样品保持恒定的总蛋白质浓度，但两种组分之间的摩尔比连续变化（图1）。具有复合物功能化学计量的样品希望显示最高的FRET信号。
这是获得溶液中复杂化学计量和任何大小组分之间测量的有力方法。因为FRET测量需要复合物的两个组分都被荧光标记，所以需要各种对照来排除标记过程的潜在伪影。理想的情况是单个位点的标记在该测定中是可取的（D'Arcy等人，2013; ...
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| Biochemical Analysis of Caspase-8-dependent Proteolysis of IRF3 in Virus-infected Cells
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Date:
2016-11-20
[Abstract] Interferon regulatory factor 3 (IRF3) is a transcription factor, which is critical for the antiviral response against a wide range of viruses (Hiscott, 2007; Ikushima et al., 2013). It gets activated in virus-infected cells via Toll like receptors (TLRs), RIG-I (retinoic acid inducible gene 1) like receptors (RLRs), cyclic GMP-AMP synthase (cGAS) – stimulator of interferon genes (STING), which are sensors of viral components in the cells (Chattopadhyay and Sen, 2014a; 2014b; Hiscott, 2007). IRF3 is a cytoplasmic protein, upon activation by virally activated sensors it gets ...
[摘要] 干扰素调节因子3（IRF3）是一种转录因子，对于广泛病毒的抗病毒反应至关重要（Hiscott，2007; Ikushima等，2013）。通过Toll样受体（TLR），RIG-I（视黄酸诱导型基因1）受体（RLR），环状GMP-AMP合成酶（cGAS） - 干扰素基因刺激剂（STING），其在病毒感染的细胞中被激活，其中是细胞中病毒组分的传感器（Chattopadhyay和Sen，2014a; 2014b; Hiscott，2007）。 IRF3是一种细胞质蛋白，当被病毒激活的传感器激活时，其被磷酸化，转移到细胞核并与基因启动子的干扰素敏感反应元件（ISRE）结合以诱导其转录（Hiscott，2007）。 IRF3具有其他功能，包括直接刺激病毒感染细胞凋亡。在该途径中，不需要IRF3的转录活性（Chattopadhyay等，2013b; Chattopadhyay等，2016; Chattopadhyay等，2010; Chattopadhyay和Sen，2010; Chattopadhyay等，2011）。这些途径受宿主因素以及病毒的负调控。我们的研究表明IRF3可以通过caspase-8依赖性切割进行蛋白水解加工（Sears等，2011）。 ...
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| Determination of VPS34/PIK3C3 Activity in vitro Utilising 32P-γATP
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Author:
Date:
2016-08-20
[Abstract] VPS34 is the only class III phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) in mammalian cells and produces the vast majority of cellular phosphatidylinositol-3-phosphate [PI(3)P]. PI(3)P is a key signalling lipid that plays many membrane trafficking roles in processes such as endocytosis and autophagy. VPS34 is a key cellular regulator, loss of function can have catastrophic effects and is embryonic lethal (Zhou et al., 2011). The levels of cellular PI(3)P can be determined by fluorescent staining techniques and can be used to monitor effects upon VPS34 activity, however it is important to ...
[摘要] VPS34是哺乳动物细胞中唯一的III类磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K），并且产生绝大多数细胞磷脂酰肌醇-3-磷酸[PI（3）P]。 PI（3）P是一个关键的信号脂质，在诸如内吞作用和自噬的过程中起许多膜运输的作用。 VPS34是关键的细胞调节剂，功能丧失可具有灾难性作用并且是胚胎致死的（Zhou等人，2011）。 细胞PI（3）P的水平可以通过荧光染色技术确定，并且可以用于监测对VPS34活性的影响，然而重要的是验证任何变化由VPS34介导，特别是作为PI（3）的替代途径， P生产是可能的，例如通过II类PI3K（Devereaux等人，2013）。 直接在体外测定VPS34活性可以是描绘特定刺激的作用的关键阶段。
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