| A Flow-assay for Farnesol Removal from Adherent Candida albicans Cultures
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Author:
Date:
2017-10-05
[Abstract] Here, we describe a protocol for a continuous flow system for C. albicans cultures growing adherent to a plastic surface. The protocol was adapted from a previous method established to simulate blood flow on endothelial cells (Wilson and Hube, 2010). The adapted protocol was used by us for the removal of molecules in C. albicans supernatants, especially farnesol, which accumulate over the time course of incubation and cannot be specifically depleted. The system used, however, allows various applications including the simulation of physiological flow conditions. Several ...
[摘要] 在这里，我们描述了用于连续流系统的协议。 白色念珠菌生长粘附在塑料表面上的培养物。 该方案根据建立以模拟内皮细胞上的血液流动的先前方法改编（Wilson和Hube，2010）。 我们使用适应方案去除C中的分子。 白色念珠菌上清液，特别是法呢醇，其在孵育的时间过程中积累并且不能被特异性地耗尽。 然而，所使用的系统允许各种应用，包括模拟生理流动条件。 制造商网站上给出了几个示例应用程序(https://ibidi.com/perfusion-system/112-ibidi-pump-system.html).
【背景】法尼醇是人类致病真菌白色念珠菌中的酵母 - 菌丝转移（Hornby等人，2001）的有效抑制剂，并且还促进了酵母生长的逆转预制长丝（Lindsay等人，2012）。群体感知分子（QSM）快速积聚在白念珠菌EED1缺失株的上清液中，并促进突变体（Polke等人）的反向形态发生和菌丝维持缺陷>，2017）。由于我们无法阻止法呢醇的合成（Polke等人，2017），我们使用了ibidi ®泵系统，通过单向去除上清液中累积的QSMs流。流动应用以及在孵育期间的恒定的培养基更换在C中显着延长了丝状化。白色念珠菌eed1Δ突变体。这表明QSM积累的成功去除，并且提供了在C中的菌丝维持和法呢醇信号之间的直接联系。白色假丝酵母。用于此协议（ibidi ...
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| Preparation of Crude Synaptosomal Fractions from Mouse Brains and Spinal Cords
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] The current protocol describes the preparation of crude synaptosomal fractions from mouse brain or spinal cord samples. In detail, a sequential protocol yielding crude synaptosomal and light membrane fractions is provided. This fast and easy method might be sufficient to assess the amount of synaptic proteins in down-steam applications like Western-blot or ELISA in e.g., mouse models of Alzheimer’s disease or other neurodegenerative conditions.
[摘要] 目前的方案描述了从小鼠脑或脊髓样品制备粗突触体部分。 详细地，提供了产生粗突触体和轻质膜部分的顺序方案。 这种快速和容易的方法可能足以在例如阿尔茨海默病或其他神经变性病症的小鼠模型中评估下蒸汽应用中的突触蛋白质的量，例如Western印迹或ELISA。
【背景】分析突触体，代表孤立的突触终端从神经元，可以产生有价值的信息，在不同的神经系统疾病的突触完整性。它们含有在特定条件下脑匀浆后从轴突末端脱离的膜结合区。目前的方案描述了一种快速和简便的浓缩粗突变体级分的方法（见图1）。这些可以用于通过蛋白质印迹定量突触蛋白质，或者可以使用密度梯度离心法进一步纯化以产生高度纯化的突触体亚级分（Gurd等人，1974）。粗突触体部分的制备可能足以评估例如的突触前和突触后蛋白如SNAP25或突触后密度蛋白95（PSD95）的量，例如，具有神经变性表型的小鼠模型（Breyhan等人，2009; Saul and Wirths，2017）。
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图1.描述顺序提取过程的流程图
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| Measurement of the Intracellular Calcium Concentration with Fura-2 AM Using a Fluorescence Plate Reader
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] Intracellular calcium elevation triggers a wide range of cellular responses. Calcium responses can be affected or modulated by membrane receptors mutations, localization, exposure to agonists/antagonists, among others (Burgos et al., 2007; Martínez et al., 2016). Changes in intracellular calcium concentration can be measured using the calcium sensitive fluorescent ratiometric dye fura-2 AM. This method is a high throughput way to measure agonist mediated calcium responses.
[摘要] 细胞内钙升高引发广泛的细胞反应。 钙响应可能受到膜受体突变，定位，暴露于激动剂/拮抗剂等的影响或调节（Burgos et al。，2007;Martínez等人，2016年））。 细胞内钙浓度的变化可以使用钙敏感荧光比例染料fura-2 AM测量。 该方法是测量激动剂介导的钙反应的高通量方法。
【背景】G蛋白偶联受体的激活触发了数百或数千个第二信使分子的产生。一旦被刺激，G蛋白偶联受体激活磷脂酶C（PLC），其将磷脂酰肌醇4,5-二磷酸酯（PIP 2 N）切割成二酰基甘油（DAG）和肌醇1 ，4,5-三磷酸酯（IP 3+）。 DAG保持膜结合，并且IP 3被释放到胞质溶胶中，其结合到内质网（ER）中的特异性IP 3'受体（钙通道）。这导致调节钙结合蛋白和蛋白激酶C（PKC）的激活的细胞内钙浓度的增加。因此，考虑到钙在生物系统中的重要性，已经建立了许多分析和测量Ca 2+水平的技术/方法。
＆NBSP;为确定细胞内Ca 2+浓度，荧光指示剂特别有用。 Ca 2 + 指示符可用于亲和力，亮度或光谱特性的变化。 Fura-2-乙酰氧基甲酯（fura-2 AM）是比例计算的钙指示剂fura-2的膜可渗透的非侵入性衍生物。 Fura-2 AM穿过细胞膜，一旦在细胞内，细胞酯酶除去乙酰氧基甲基。 Ca 2 + -bound fura-2 AM在335 ...
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