| Expression and Purification of a Mammalian P2X7 Receptor from Sf9 Insect Cells
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] The P2X7 receptor is an extracellular ATP-gated ion channel found only in eukaryotes (Bartlett et al., 2014). Due to its unique properties among P2X receptors, such as formation of a large conductance pore, the P2X7 receptor has been implicated in devastating diseases like chronic pain (North and Jarvis, 2013). However, mechanisms underlying the P2X7 specific properties remain poorly understood, partly because purification of this eukaryotic membrane protein has been challenging. Here we describe a detailed protocol for expressing and purifying a mammalian P2X7 receptor using an ...
[摘要] P2X7受体是仅在真核生物中发现的胞外ATP门控离子通道（Bartlett等，2014）。由于其P2X受体之间的独特性质，例如大电导孔的形成，P2X7受体已经涉及破坏性疾病如慢性疼痛（North和Jarvis，2013）。然而，P2X7特异性属性的机制仍然知之甚少，部分原因是纯化这种真核膜蛋白是一个挑战。在这里，我们描述了使用昆虫细胞 - 杆状病毒系统表达和纯化哺乳动物P2X7受体的详细方案。 P2X7受体在作为GFP融合蛋白的Sf9昆虫细胞中表达，并用含有Triton X-100洗涤剂的缓冲液溶解。然后使用Strep-Tactin亲和层析在含有十二烷基麦芽糖苷的缓冲液中纯化P2X7-GFP融合蛋白。在通过凝血酶酶切割连接的GFP和Strep-标签后，使用大小排阻色谱分离P2X7受体。该方法通常从6L的Sf9培养物产生约2mg的纯化蛋白质。纯化的蛋白质可以用含有15％甘油的缓冲液在4℃下储存至少2个月，并用于各种功能和结构研究（Karasawa和Kawate，2016）。
【背景】P2X7受体是嘌呤能P2X受体家族的七种亚型之一，并且是广泛疾病如神经退行性疾病，癫痫和神经性疼痛的有希望的新型药物靶点（North和Jarvis，2013; Bhattacharya和Biber， ...
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| Liposome Disruption Assay to Examine Lytic Properties of Biomolecules
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] Proteins may have three dimensional structural or amino acid features that suggest a role in targeting and disrupting lipids within cell membranes. It is often necessary to experimentally investigate if these proteins and biomolecules are able to disrupt membranes in order to conclusively characterize the function of these biomolecules. Here, we describe an in vitro assay to evaluate the membrane lytic properties of proteins and biomolecules. Large unilamellar vesicles (liposomes) containing carboxyfluorescein at fluorescence-quenching concentrations are treated with the biomolecule ...
[摘要] 蛋白质可以具有三维结构或氨基酸特征，其表明在细胞膜内靶向和破坏脂质的作用。通常有必要进行实验研究，如果这些蛋白质和生物分子能够破坏膜，以确定性地表征这些生物分子的功能。在这里，我们描述了一种体外实验来评估蛋白质和生物分子的膜裂解性质。用荧光猝灭浓度含有羧基荧光素的大单层囊泡（脂质体）用感兴趣的生物分子进行处理。由于染料从脂质体泄漏而导致的荧光增加，随后在缓冲液中的稀释表明生物分子足以破坏脂质体和膜。另外，由于脂质体破裂可能通过孔形成或通过类似于洗涤剂的脂类的一般溶解而发生，因此我们提供了区分这两种机制的方法。可以通过检查与适合孔的葡聚糖分子的羧基荧光素释放的封锁来鉴定和评估孔形成。这里描述的方法用于确定疟疾疫苗候选人CelTOS和促凋亡Bax通过孔形成破坏脂质体（Saito等人，2000; Jimah等人，2016） ）。由于生物分子的膜脂质结合先于膜破裂，我们推荐使用伴侣方案：Jimah等人，2017。
【背景】该方案提出了评估蛋白质和其他生物分子的膜裂解性质的程序。该方案旨在清楚地描述研究生物分子的膜破坏性质所需的各种实验步骤。最后，该方案描述了膜破坏的定量测量，可用于提供对脂质体破坏的动力学和机制的了解。该方案成功地用于研究疟疾疫苗候选人CelTOS，其提供了对CelTOS的第一次体外功能测定的清楚描述。该方案的应用揭示，对于不饱和脂肪酸和多孔元素的CelTOS（透明性蛋白质）破坏了含有磷脂酸的膜。这一见解表明，CelTOS由入侵宿主细胞内的疟疾寄生虫分泌，以破坏宿主细胞膜并使寄生虫出现（Jimah等人，2016）。最后，该测定可以容易地应用于研究小分子，抗体或肽对CelTOS介导的脂质体破坏的抑制。当为CelTOS设计时，该协议易于泛化，适用于任何其他感兴趣的生物分子。 ...
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