| Sterol Analysis in Kluyveromyces lactis
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] Sterols are essential lipids of most eukaryotic cells with multiple functions (structural, regulatory and developmental). Sterol profile of yeast cells is often determined during the studies of ergosterol synthesis mutants used to uncover a number of functions for various sterols in yeast cells. Molecular studies of ergosterol biosynthesis have been also employed to identify essential steps in the pathway against which antifungals might be developed. We present here a protocol for the isolation of non-saponifiable lipids (sterols) from Kluyveromyces lactis yeast cells and a ...
[摘要] 甾醇是具有多种功能（结构，调节和发育）的大多数真核细胞的必需脂质。 在用于揭示酵母细胞中各种甾醇的许多功能的麦角甾醇合成突变体的研究期间，酵母细胞的甾醇分布通常被确定。 麦角甾醇生物合成的分子研究也被用于鉴定可能开发抗真菌剂途径的基本步骤。 我们在这里介绍从乳酸克鲁维酵母酵母细胞中分离不皂化脂质（甾醇）的方案和用于在实验室中用标准设备进行的脂质提取物（HPLC）中固醇的定量分析的色谱法。
【背景】在酵母细胞中发现的主要膜固醇的麦角固醇在哺乳动物系统中与胆固醇相似的细胞膜中起着结构的作用。通过影响膜的刚性，流动性和渗透性，甾醇已被证明对膜的许多重要物理特征负责。通过它们与磷脂和鞘脂的相互作用，提出甾醇以维持蛋白质的侧向异质性和质膜中的脂质分布，因为它们在诱导称为脂筏的微区域中的推定作用（Dupont等人，2011; Souza等， 2011）。酵母中的甾醇生物合成是一种能量昂贵的多步需氧过程，需要血红素和分子氧。谷歌甾醇及其生物合成步骤是对宿主生物体胆固醇合成影响较小的抗真菌化合物的主要目标（Daum等，1998）。麦角甾醇及其一些生物合成中间体（角鲨烯，7-脱氢胆固醇）均属于直接吸引人的化学物质。因此，用于甾醇分离的简单可靠的方法是非常有益的（Valachovic和Hapala，2017）。在该方案中，我们描述了用于测定酵母细胞中甾醇分布的固醇分离的分析方法。
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| Measurement of Energy-dependent Rhodamine 6G Efflux in Yeast Species
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] Rhodamine 6G is a highly fluorescent dye often used to determine the transport activity of yeast membrane efflux pumps. The ATP-binding cassette transporter KlPdr5p confers resistance to several unrelated drugs in Kluyveromyces lactis. KlPdr5p also extrudes rhodamine 6G (R6G) from intact yeast cells in an energy-dependent manner. Incubation of yeast cells in the presence of 2-deoxy-D-glucose (inhibitor of glycolysis) and R6G (mitochondrial ATPase inhibitor) leads to marked depletion of intracellular ATP pool (Kolaczkowski et al., 1996). An active KlPdr5p ...
[摘要] 罗丹明6G是一种高荧光染料，常用于测定酵母膜外排泵的运输活性。 ATP结合盒转运蛋白Klr5p赋予乳酸克鲁维酵酵菌中几种不相关药物的抗性。 Pdr5p还以能量依赖的方式从完整的酵母细胞中挤出罗丹明6G（R6G）。 在2-脱氧-D-葡萄糖（糖酵解抑制剂）和R6G（线粒体ATP酶抑制剂）存在下酵母细胞的孵育导致细胞内ATP池的显着消耗（Kolaczkowski等人，1996）。 从完整的酵母细胞中可以直接测量R6G的荧光的直接测量PdF5p介导的来自完整酵母细胞的R6G的挤出。
【背景】多药物外排泵广泛分布，可在所有生物种类中找到。它们代表抗菌素耐药性的重要机制。量化外排泵活性的能力对于理解其对生理过程的贡献和评估潜在治疗药物（例如，外排抑制剂）的有效性（Blair和Piddock，2016）是必要的。外排活动测量的方法主要依赖于两种不同的机制。一些方法直接测量底物流出，即，多少基质被泵出，其他方法测量细胞内的底物分子积累，其水平然后用于间接推断流出。然而，后者由于可改变膜渗透性而改变了染料流入速率（Blair和Piddock，2016）的敏感性较差。 R6G在生长中的积累。白念珠菌细胞与ABC转运蛋白念珠菌药物抗性1（CDR1 ...
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