| Delivery of the Cas9 or TevCas9 System into Phaeodactylum tricornutum via Conjugation of Plasmids from a Bacterial Donor
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Diatoms are an ecologically important group of eukaryotic microalgae with properties that make them attractive for biotechnological applications such as biofuels, foods, cosmetics and pharmaceuticals. Phaeodactylum tricornutum is a model diatom with defined culture conditions, but routine genetic manipulations are hindered by a lack of simple and robust genetic tools. One obstacle to efficient engineering of P. tricornutum is that the current selection methods for P. tricornutum transformants depend on the use of a limited number of antibiotic resistance genes. An ...
[摘要] 硅藻是一种具有重要生态意义的真核微藻类，其特性使其对生物燃料，食品，化妆品和药品等生物技术应用具有吸引力。 Phaeodactylum tricornutum 是具有确定培养条件的模型硅藻，但缺乏简单而强大的遗传工具阻碍了常规遗传操作。有效设计 P的一个障碍。 tricornutum 是 P的当前选择方法。 tricornutum 转化体依赖于使用有限数量的抗生素抗性基因。另一种更具成本效益的选择方法是产生 P的营养缺陷型菌株。通过敲除参与氨基酸生物合成的关键基因，并使用基于质粒的生物合成基因拷贝作为选择标记，使三角酵母。以前关于 P基因敲除的研究。 tricornutum 使用biolistic转换将CRISPR-Cas9系统传递到 P.藻。非复制质粒的生物射弹转化可导致对 P的不期望的损伤。由于转化的DNA随机整合到基因组中，tricornutum 。随后固化编辑的细胞以防止Cas9的长期过表达是非常困难的，因为目前没有方法来切除整合的质粒。该协议采用新方法将Cas9或TevCas9系统传送到 P. tricornutum 通过来自细菌供体细胞的质粒的缀合。该过程涉及：1）设计和插入靶向 P的guideRNA。将tricornutum 尿素酶基因导入TevCas9表达质粒，该质粒也编码转移的接合起点，2）将该质粒安装在含有含有接合机制的质粒（pTA-Mob）的大肠杆菌中， ...
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| CRISPR/Cas9 Gene Editing in the Marine Diatom Phaeodactylum tricornutum
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] The establishment of the CRISPR/Cas9 technology in diatoms (Hopes et al., 2016; Nymark et al., 2016) enables a simple, inexpensive and effective way of introducing targeted alterations in the genomic DNA of this highly important group of eukaryotic phytoplankton. Diatoms are of interest as model microorganisms in a variety of areas ranging from oceanography to materials science, in nano- and environmental biotechnology, and are presently being investigated as a source of renewable carbon-neutral fuel and chemicals. Here we present a detailed protocol of how to perform ...
[摘要] 在硅藻（Hopes ，2016; Nymark等人，2016）中建立了CRISPR / Cas9技术，使得能够简单，廉价和有效地引入目标 这个非常重要的真核浮游植物群的基因组DNA的改变。 硅藻在纳米和环境生物技术领域从海洋学到材料科学，各种领域的示范性微生物都是有意义的，目前正在作为可再生碳中和燃料和化学品的来源进行调查。 在这里，我们提出了如何进行海洋硅藻三角褐指藻CRISPR / Cas9基因编辑的详细方案，包括：1）在硅藻优化的CRISPR / Cas9载体（pKS diaCas9）中插入引导RNA靶位点 -sgRNA），2）用于将pKS diaCas9-sgRNA质粒导入P的生物弹道转化。 三分支毛细胞和3）基于高分辨率熔融的PCR测定以筛选CRISPR / Cas9诱导的突变。
【背景】CRISPR / Cas9系统已被证明是许多真核生物中非常有效和成功的基因组编辑系统，现在也包括微藻（Hopes等人，2016; Nymark等人）。 ，2016; Shin 等人，2016）。 CRISPR / Cas9系统包括引导RNA（gRNA）和称为Cas9的核酸酶（Sander and Joung，2014）。 这两个分子形成复合物，其中gRNA将复合物引导至感兴趣的靶标。 ...
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