| Identification of Insertion Site by RESDA-PCR in Chlamydomonas Mutants Generated by AphVIII Random Insertional Mutagenesis
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] Chlamydomonas reinhardtii is frequently used as a model organism to study fundamental processes in photosynthesis, metabolism, and flagellar biology. Versatile tool boxes have been developed for this alga (Fuhrmann et al., 1999; Schroda et al., 2000; Schroda, 2006). Among them, forward genetic approach has been intensively used, mostly because of the high efficiency in the generation of hundreds of thousands of mutants by random insertional mutagenesis and the haploid nature therefore phenotypic analysis can be done in the first generation (Cagnon et al., ...
[摘要] 莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）是光合作用，代谢和鞭毛生物学的基础研究者。已经为这种藻类开发了多功能的工具箱（Fuhrmann等人，1999; Schroda等人，2000; Schroda，2006）。其中，正向遗传方法已经被广泛使用，主要是因为通过随机插入诱变产生了数十万个突变体的高效率，并且可以在第一代进行单倍体性质表型分析（Cagnon等人 2013，Tunçay et。 2013）。在正向遗传方法中应用高通量方法的主要瓶颈是鉴定与观察到的表型相关的遗传损伤。在该协议中，我们详细描述了最初在（González-Ballester等人，2005）中报道的限制性定点扩增PCR（RESDA-PCR）的改进版本。优化包括引物组合的优化，DNA聚合酶的选择，PCR循环参数的优化以及PCR产物直接测序的应用。这些修改使得获得特定的PCR产物变得更加容易，并且加速了亚克隆步骤以更快地获得测序数据。
【背景】除了限制酶位点定向扩增PCR（RESDA-PCR）（González-Ballester等人，2005）之外，还发现了其它几种分子技术。 包括Genome ...
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| Membrane Lipid Screen to Identify Molecular Targets of Biomolecules
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] Proteins that bind to and disrupt cell membranes may target specific phospholipids. Here we describe a protocol to identify the lipid targets of proteins and biomolecules. First, we describe a screen to identify lipids in membranes that are specifically bound by the biomolecule of interest. Second, we describe a method for determining if the presence of these lipids within membranes is necessary for membrane disruption. The methods described here were used to determine that the malaria vaccine candidate CelTOS disrupts cell membranes by specifically targeting phosphatidic acid (Jimah et al. ...
[摘要] 结合细胞膜并破坏细胞膜的蛋白可能靶向特定的磷脂。 这里我们描述了一种鉴定蛋白质和生物分子的脂质靶标的方案。 首先，我们描述了一个屏幕，用于识别由感兴趣的生物分子特异性结合的膜中的脂质。 第二，我们描述了一种确定膜中这些脂质的存在是否是膜破坏所必需的方法。 这里描述的方法用于确定疟疾疫苗候选人CelTOS通过特异性靶向磷脂酸来破坏细胞膜（Jimah等人，2016）。 该协议具有协同协议：“脂质体破碎测定以检查生物分子的溶解性质”，其可用于检查生物分子破坏由按照该协议确定的脂质靶标组成的膜的能力（Jimah等人 ，2017）。
【背景】具有膜破坏活性的蛋白质和生物分子，例如孔形成或膜融合，可以靶向膜内的特定脂质。脂质特异性孔隙形成的实例包括取决于磷脂酸用于孔形成的疟原虫CelTOS和胆固醇依赖性细胞溶质蛋白（Jimah等人，2016; Lukoyanova et al。，2016）。 CelTOS（卵磷脂和子孢子的细胞遍历蛋白）是一种疟疾寄生虫蛋白，其通过孔形成破坏宿主细胞膜，以使得细胞遍历过程中寄生虫免受入侵的宿主细胞的退出（Kariu等人，2006） ; ...
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| Liposome Disruption Assay to Examine Lytic Properties of Biomolecules
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Author:
Date:
2017-08-05
[Abstract] Proteins may have three dimensional structural or amino acid features that suggest a role in targeting and disrupting lipids within cell membranes. It is often necessary to experimentally investigate if these proteins and biomolecules are able to disrupt membranes in order to conclusively characterize the function of these biomolecules. Here, we describe an in vitro assay to evaluate the membrane lytic properties of proteins and biomolecules. Large unilamellar vesicles (liposomes) containing carboxyfluorescein at fluorescence-quenching concentrations are treated with the biomolecule ...
[摘要] 蛋白质可以具有三维结构或氨基酸特征，其表明在细胞膜内靶向和破坏脂质的作用。通常有必要进行实验研究，如果这些蛋白质和生物分子能够破坏膜，以确定性地表征这些生物分子的功能。在这里，我们描述了一种体外实验来评估蛋白质和生物分子的膜裂解性质。用荧光猝灭浓度含有羧基荧光素的大单层囊泡（脂质体）用感兴趣的生物分子进行处理。由于染料从脂质体泄漏而导致的荧光增加，随后在缓冲液中的稀释表明生物分子足以破坏脂质体和膜。另外，由于脂质体破裂可能通过孔形成或通过类似于洗涤剂的脂类的一般溶解而发生，因此我们提供了区分这两种机制的方法。可以通过检查与适合孔的葡聚糖分子的羧基荧光素释放的封锁来鉴定和评估孔形成。这里描述的方法用于确定疟疾疫苗候选人CelTOS和促凋亡Bax通过孔形成破坏脂质体（Saito等人，2000; Jimah等人，2016） ）。由于生物分子的膜脂质结合先于膜破裂，我们推荐使用伴侣方案：Jimah等人，2017。
【背景】该方案提出了评估蛋白质和其他生物分子的膜裂解性质的程序。该方案旨在清楚地描述研究生物分子的膜破坏性质所需的各种实验步骤。最后，该方案描述了膜破坏的定量测量，可用于提供对脂质体破坏的动力学和机制的了解。该方案成功地用于研究疟疾疫苗候选人CelTOS，其提供了对CelTOS的第一次体外功能测定的清楚描述。该方案的应用揭示，对于不饱和脂肪酸和多孔元素的CelTOS（透明性蛋白质）破坏了含有磷脂酸的膜。这一见解表明，CelTOS由入侵宿主细胞内的疟疾寄生虫分泌，以破坏宿主细胞膜并使寄生虫出现（Jimah等人，2016）。最后，该测定可以容易地应用于研究小分子，抗体或肽对CelTOS介导的脂质体破坏的抑制。当为CelTOS设计时，该协议易于泛化，适用于任何其他感兴趣的生物分子。 ...
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