| High-throughput YO-PRO-1 Uptake Assay for P2X7 Receptors Expressed in HEK Cells
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] P2X7 receptors are extracellular ATP-gated ion channels that play broad physiological and pathological roles in animals (Sluyter, 2017). Activation of P2X7 receptors lead to the opening of membrane channels permeable for small cations like Na+ and Ca2+ as well as fluorescent dyes such as YO-PRO-1 (Alves et al., 2014). Taking advantage of this dye-permeability, YO-PRO-1 uptake assays have been widely used to probe P2X7 receptor activity (Surprenant et al., 1996; Rassendren et al., 1997; Karasawa et al., 2017). Here we describe a step by ...
[摘要] P2X7受体是细胞外ATP门控离子通道，在动物中发挥广泛的生理和病理作用（Sluyter，2017）。 P2X7受体的激活导致膜通道的开放可渗透小阳离子如Na + 和Ca 2 + 以及荧光染料如YO-PRO-1（Alves） et al。，2014）。 利用这种染料渗透性，YO-PRO-1摄取试验已被广泛用于探测P2X7受体活性（Surprenant et al。，1996; Rassendren et al。 ，1997; Karasawa et al。，2017）。 在这里，我们描述了使用表达P2X7受体的HEK293细胞进行高通量YO-PRO-1摄取测定的逐步方案。 这个为期3天的方案特别适用于检查小分子和突变对P2X7受体功能的影响。 该协议改编自我们之前发表的论文（Karasawa和Kawate，2016）。
【背景】P2X7受体打开可渗透阳离子的膜通道（Surprenant et al。，1996; Sluyter，2017）。虽然电生理学仍然是量化P2X7受体活性的金标准，但这种专门技术可能并不容易获得。此外，电生理学不适合高通量筛选，因为每次记录需要大量的时间和操作。因此，荧光分子的摄取是一种广泛使用的替代方法，特别是用于筛选多种条件/突变体（Cankurtaran-Sayar et al。，2009; Qu et al。 ...
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| Expression and Purification of a Mammalian P2X7 Receptor from Sf9 Insect Cells
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] The P2X7 receptor is an extracellular ATP-gated ion channel found only in eukaryotes (Bartlett et al., 2014). Due to its unique properties among P2X receptors, such as formation of a large conductance pore, the P2X7 receptor has been implicated in devastating diseases like chronic pain (North and Jarvis, 2013). However, mechanisms underlying the P2X7 specific properties remain poorly understood, partly because purification of this eukaryotic membrane protein has been challenging. Here we describe a detailed protocol for expressing and purifying a mammalian P2X7 receptor using an ...
[摘要] P2X7受体是仅在真核生物中发现的胞外ATP门控离子通道（Bartlett等，2014）。由于其P2X受体之间的独特性质，例如大电导孔的形成，P2X7受体已经涉及破坏性疾病如慢性疼痛（North和Jarvis，2013）。然而，P2X7特异性属性的机制仍然知之甚少，部分原因是纯化这种真核膜蛋白是一个挑战。在这里，我们描述了使用昆虫细胞 - 杆状病毒系统表达和纯化哺乳动物P2X7受体的详细方案。 P2X7受体在作为GFP融合蛋白的Sf9昆虫细胞中表达，并用含有Triton X-100洗涤剂的缓冲液溶解。然后使用Strep-Tactin亲和层析在含有十二烷基麦芽糖苷的缓冲液中纯化P2X7-GFP融合蛋白。在通过凝血酶酶切割连接的GFP和Strep-标签后，使用大小排阻色谱分离P2X7受体。该方法通常从6L的Sf9培养物产生约2mg的纯化蛋白质。纯化的蛋白质可以用含有15％甘油的缓冲液在4℃下储存至少2个月，并用于各种功能和结构研究（Karasawa和Kawate，2016）。
【背景】P2X7受体是嘌呤能P2X受体家族的七种亚型之一，并且是广泛疾病如神经退行性疾病，癫痫和神经性疼痛的有希望的新型药物靶点（North和Jarvis，2013; Bhattacharya和Biber， ...
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