| In vitro Reconstitution Assays of Arabidopsis 20S Proteasome
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Author:
Date:
2021-04-05
[Abstract] The majority of cellular proteins are degraded by the 26S proteasome in eukaryotes. However, intrinsically disordered proteins (IDPs), which contain large portions of unstructured regions and are inherently unstable, are degraded via the ubiquitin-independent 20S proteasome. Emerging evidence indicates that plant IDP homeostasis may also be controlled by the 20S proteasome. Relatively little is known about the specific functions of the 20S proteasome and the regulatory mechanisms of IDP degradation in plants compared to other species because there is a lack of systematic protocols for in ...
[摘要] [摘要]大多数细胞蛋白的s的降解通过26S在真核生物蛋白酶。但是，内在无序的蛋白质（IDPs）包含大量的非结构化区域，并且内在地不稳定，因此很容易通过不依赖泛素的20S蛋白酶体降解。越来越多的证据最近显示ň植物境内流离失所者的平衡也可以通过20S蛋白酶控制。但是，由于缺乏用于体外分离20S蛋白酶体和降解测定的系统协议，因此我们对植物中IDP和20S蛋白酶体降解的功能和调控机制的研究和理解一直处于婴儿期与其他生物。在这里，我们通过采用和修改先前公开的方法，对拟南芥中20S蛋白酶体进行体外重组测定的详细方案。在此获得20S核心蛋白酶体的主要策略是从26S蛋白酶体中去除19S调节亚基。该协议包括两个主要部分：1）的来自表达表位标记的PAG1稳定的转基因品系20S蛋白酶体亲和纯化，的20S蛋白酶（程序AD）的基本组成部分; 2 ）体外20S蛋白酶体降解测定法（方法E）。我们预计该协议将提供一种简单有效的方法来研究体外20S蛋白酶体降解，并促进植物中蛋白质代谢的研究。
[背景]蛋白质的降解通常是通过真核生物中的蛋白酶体来实现的。整合的26S蛋白酶体由两个亚颗粒组成：一个或两个末端的19S调节颗粒（RP），用作蛋白酶体激活剂；和20S核心蛋白酶体（CP），执行降解过程。大多数真核蛋白被多聚泛素化并导入26S蛋白酶体进行降解。然而，含有固有蛋白质无序已发现的区域直接通过破坏一个由20S蛋白酶的泛素依赖性降解（本日产等人，2014） ...
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| Ubiquitin Proteasome Activity Measurement in Total Plant Extracts
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] The fine-tuned balance of protein level, conformation and location within the cell is vital for the dynamic changes required for a cell to respond to a given stimulus. This requires the regulated turnover of damaged or short-lived proteins through the ubiquitin proteasome system (UPS). Thus, the protease activity of the proteasome is adjusted to meet the current demands of protein degradation via the UPS within the cell. We describe the adaptation of an intramolecular quenched fluorescence assay utilizing substrate-mimic peptides for the measurement of proteasome activity in total plant ...
[摘要] 细胞内的蛋白质水平，构象和位置的微调平衡对于细胞对给定刺激作出反应所需的动态变化是至关重要的。 这需要通过泛素蛋白酶体系统（UPS）调节受损或短寿命蛋白质的周转。 因此，调节蛋白酶体的蛋白酶活性以满足目前通过细胞内的UPS的蛋白质降解的需求。 我们描述了使用底物 - 模拟肽进行分子内淬灭荧光测定来测定总植物提取物中蛋白酶体活性的适应性。 肽底物含有侧向于剪切键的供体 - 猝灭剂对。 切割后，随后随时测量产物的去质子供体发射的增加，并用于计算相对蛋白酶体活性。
【背景】泛素蛋白酶体系统（UPS）是真核细胞中主要的蛋白质降解机制，因此，UPS对许多细胞过程的调节至关重要，包括信号传导，细胞周期，囊泡运输和免疫。用于营业额的蛋白质通过泛素的共价连接标记，然后被26S蛋白酶体降解。 26S蛋白酶体由两个亚颗粒组成，即20S核心蛋白酶（CP），其分隔蛋白酶活性位点和19S调节颗粒，其将适当的底物识别并转移到CP腔中进行分解。调节蛋白酶体活性以维持蛋白酶抑制以响应内部和外部条件的波动。我们最近显示，UPS涉及植物免疫的几个方面，一系列植物和动物病原体颠覆了UPS来增强其毒力（Üstünet al。，2013;üstünet al。，2014;ÜstünandBörnke，2015 ;Üstünet ...
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