pMAX-GFP

公司名称: Addgene

产品编号: VDF-1012

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Ailing Zhang, Shogo Sawaguchi, Entzu Wan, Mitsutaka Ogawa and Tetsuya Okajima

Published online: 2018-08-20

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Protocol for Notch-ligand Binding Assays Using Dynabeads

Author:

Shogo Sawaguchi, Mitsutaka Ogawa and Tetsuya Okajima,

Date:

2017-10-20

[Abstract] This protocol describes how to measure interaction between Notch receptors and their ligands by cell-based assay using Dynabeads. We have used the protocol to determine binding capacity between Notch1-transfected HEK293T cells and ligand-coated Dynabeads. Expression of Eogt in Notch1-expressing cells promoted binding toward DLL4-coated beads, but not JAG1-coated beads. The Notch-ligand assay using Dynabeads suggested that Eogt facilitates DLL4-Notch1 interaction (Sawaguchi et al., 2017). [摘要] 该协议描述了如何使用Dynabeads通过基于细胞的测定来测量Notch受体及其配体之间的相互作用。我们已经使用方案来确定Notch1转染的HEK293T细胞和配体包被的Dynabeads之间的结合能力。在Notch1表达细胞中表达Eogt 促进了对DLL4包被的珠粒的结合，而不是JAG1包被的珠粒。使用Dynabeads的Notch-配体测定表明，Eogt 有助于DLL4-Notch1相互作用（Sawaguchi等人，2017）。
【背景】Notch信号通路调节许多类型的细胞事件，如所有后生动物中的增殖，细胞命运测定和细胞分化（Mumm和Kopan，2000）。为了启动Notch信号传导，Notch受体的细胞外结构域与其配体结合，呈现在相对细胞上的Delta样（DLL）配体或Jagged（JAG）配体）。

Notch受体的表皮生长因子（EGF）样结构域对配体结合至关重要，并由包含O-岩藻糖，O-葡萄糖和O-GlcNAc聚糖的特定聚糖修饰（Stanley和Okajima，2010）。这些聚糖中的一些通过调节Notch受体和配体之间的物理相互作用（Moloney等人，2000）用作Notch信号传导途径的调节剂。为了研究O-GlcNAc是否调节Notch-配体相互作用，我们开发了一种基于Dynabeads的Notch-配体结合测定。在该测定中，在HEK293T细胞上表达的Notch受体与用DLL4-Fc或JAG1-Fc包被的Dynabeads蛋白A孵育。与用于其他结合测定法的可溶性配体不同，Notch配体的方向固定在珠上，使得它们表现得像配体表达细胞。因此，检测到的结合表示反式结合而不是顺式结合，当Notch受体及其配体在相同的细胞中表达时发生。该测定表明，通过Eogt ...

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