| 3D Co-culture System of Tumor-associated Macrophages and Ovarian Cancer Cells
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] Ovarian cancer is fairly unique in that ovarian carcinoma cells can detach and spread directly through peritoneal cavity. It has been unclear, however, how detached cancer cells survive in the peritoneum and form spheroid structure. We have recently reported that there is a strong correlation between Tumor-associated macrophages (TAMs)-associated spheroid and clinical pathology of ovarian cancer, and that TAMs promote spheroid formation and tumor growth at early stages of transcoelomic metastasis in orthotopic mouse models. We have established an in vitro spheroid formation assay ...
[摘要] 卵巢癌相当独特，因为卵巢癌细胞可以通过腹膜腔直接分离和扩散。然而，目前还不清楚癌细胞如何在腹膜中存活并形成球状结构。我们最近报道，肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）相关的球状体与卵巢癌的临床病理学之间存在很强的相关性，并且TAMs在原位小鼠模型中促进球体形成和肿瘤生长在转移瘤体转移的早期阶段。我们已经建立了使用3D共培养系统的体外球体形成测定法，其中小鼠GFP + F4 / 80 + CD206 F 从含有卵巢癌的供体番茄lysM-cre小鼠的球状体中分离的TAM与在含有2％基质胶的培养基中的ID8细胞（TAM:ID8比例为1:10）混合并接种到用Matrigel预包被的24孔板上。由于transcoelomic转移也与许多其他癌症，如胰腺癌和结肠癌，TAM介导的球体形成实验将提供一个有用的方法来定义卵巢癌和其他transcoelomic转移癌症的分子机制和治疗目标。
【背景】在美国，卵巢癌（OC）是第二常见的妇科癌症和主要死亡原因（Jemal等人，2009; Siegel等人，2012年） ）。 OC预后不良的主要原因是腹腔内和盆腔广泛植入转移，通常手术无法完全切除。对腹膜转移现象最广泛的解释是肿瘤细胞在延伸到腹膜表面后与原发肿瘤分离，并在腹膜内播种之前通过腹膜液输送到整个腹腔。有人提出，转移瘤的转移过程可分为几个步骤：1）细胞脱落，失巢凋亡的存活和抵抗; ...
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| Isolation of Primary Human Skeletal Muscle Cells
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Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] Primary myoblast culture is a valuable tool in research of muscle disease, pathophysiology, and pharmacology. This protocol describes techniques for dissociation of cells from human skeletal muscle biopsies and enrichment for a highly myogenic population by fluorescence-activated cell sorting (FACS). We also describe methods for assessing myogenicity and population expansion for subsequent in vitro study.
[摘要] 原代成肌细胞培养是研究肌肉疾病，病理生理学和药理学的有用工具。 该协议描述了通过荧光激活细胞分选（FACS）从人类骨骼肌活检中分离细胞并富集高度肌原细胞的技术。 我们还描述了用于评估随后的体外研究中肌原性和群体扩张的方法。
【背景】来自肌肉活组织检查的原代人成肌细胞是模拟体外人体肌肉疾病的有价值的资源。成肌细胞增殖，分化和融合的改变是许多神经肌肉疾病所共有的特征，并且可以用于测定基于细胞的和药理学的治疗。人类骨骼肌活组织检查，尤其是那些受疾病影响的人，通常含有大量的非肌原细胞，如脂肪细胞和成纤维细胞。因此，纯化肌原细胞进行骨骼肌发育和疾病的体外研究是非常重要的。肌肉疾病的早期研究涉及使用组织外植体或未纯化的分离细胞（Geiger和Garvin，1957; Herrmann等人，1960; Goyle等人，1967; Bishop 1971年），后来，Blau和Webster引入了一种预先电镀技术去除成纤维细胞（Blau and ...
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| Cytosolic and Nuclear Delivery of CRISPR/Cas9-ribonucleoprotein for Gene Editing Using Arginine Functionalized Gold Nanoparticles
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Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] In this protocol, engineered Cas9-ribonucleoprotein (Cas9 protein and sgRNA, together called Cas9-RNP) and gold nanoparticles are used to make nanoassemblies that are employed to deliver Cas9-RNP into cell cytoplasm and nucleus. Cas9 protein is engineered with an N-terminus glutamic acid tag (E-tag or En, where n = the number of glutamic acid in an E-tag and usually n = 15 or 20), C-terminus nuclear localizing signal (NLS), and a C-terminus 6xHis-tag. [Cas9En hereafter]
To use this protocol, the first step is to generate the required materials (gold nanoparticles, recombinant ...
[摘要] 在该方案中，使用工程化的Cas9-核糖核蛋白（Cas9蛋白和sgRNA，一起称为Cas9-RNP）和金纳米颗粒制备用于将Cas9-RNP递送至细胞质和细胞核的纳米组件。 Cas9蛋白用N末端谷氨酸标签（E标签或En，其中n = E-标签中的谷氨酸数目，通常n = 15或20），C末端核定位信号（NLS） ，和C末端6xHis标签。 [Cas9En]
为了使用该方案，第一步是产生所需的材料（金纳米颗粒，重组Cas9En和sgRNA）。金纳米颗粒的实验室合成可能需要长达数周，但可以批量合成，可以使用多年，而不损害质量。可以从常规SpCas9基因（Addgene plasmid id = 47327）克隆Cas9En，并使用不属于该方案的标准实验室程序进行表达和纯化。类似地，可以使用来自模板基因（Addgene plasmid id = 51765）的体外转录实验室合成sgRNA，或者可以从各种来源购买。
一旦这些材料准备就绪，制作Cas9En-RNP复合物大约需要30分钟，并使得Cas9En-RNP /纳米纳米组件立即用于输送（图1）。完成交付（90-95％细胞质和核递送）在不到3小时内实现。后续编辑实验需要根据用户需要额外的时间。
报道了精氨酸功能化金纳米粒子（ArgNPs）（Yang等人，2011），重组Cas9En的表达和sgRNA的体外合成的合成（Mout ...
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