Protocol for Peptide Synthesis on Spectrally Encoded Beads for MRBLE-pep Assays
|
Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] Every living cell relies on signal transduction pathways comprised of protein-protein interactions (PPIs). In many cases, these PPIs are between a folded protein domain and a short linear motif (SLiM) within an unstructured region of a protein. As a result of this small interaction interface (3-10 amino acids), the affinities of SLiM-mediated interactions are typically weak (Kds of ~1-10 µM), allowing physiologically relevant changes in cellular concentrations of either protein partner to dictate changes in occupancy and thereby transmit cellular signals. However, these ...
[摘要] [摘要] 每个活细胞都依赖于由蛋白-蛋白相互作用(PPI)组成的信号转导途径。在许多情况下,这些PPI位于蛋白质非结构化区域内的折叠蛋白质结构域和短线性基序(SLiM )之间。由于这种小交互界面(3-10个氨基酸)的结果,的亲和力了SLiM 介导的相互作用通常是弱(ķ d 小号〜1-10μM的),允许在任一蛋白伴侣的细胞浓度至生理学相关的变化指示占用率的变化,从而传输蜂窝信号。然而,这些弱的亲和力也使得对这些相互作用的检测和定量测量具有挑战性并且劳动强度大。为了解决这个问题,我们最近开发了MRBLE-pep,该技术利用在光谱编码的水凝胶珠上合成的肽库,可以并行测量蛋白质和许多不同肽之间的多重亲和力。与传统方法相比,该方法显着减少了蛋白质和多肽的数量以及测量蛋白质-肽亲和力所需的时间。在这里,我们提供了详细的协议,描述了如何:(1)功能化带有游离胺基的聚乙二醇二丙烯酸酯(PEG-DA)MRBLE磁珠,(2)在功能化的MRBLE上合成肽库,(3)通过MALDI质量验证合成的肽序列光谱分析和量化MRBLE上肽覆盖的均匀性,(4)在多重蛋白结合测定中使用MRBLE结合的肽库,以及(5)分析结合数据以确定结合亲和力。我们预计,该协议对于其他希望在自己的实验室中使用MRBLE-pep的研究人员以及对固相肽合成和蛋白质-蛋白质结合测定法开发广泛感兴趣的研究人员而言,将证明是有用的。 ...
|
|
Isolation, Culture, and Staining of Single Myofibers
|
Author:
Date:
2016-10-05
[Abstract] Adult skeletal muscle regeneration is orchestrated by a specialized population of adult stem cells called satellite cells, which are localized between the basal lamina and the plasma membrane of myofibers. The process of satellite cell-activation, proliferation, and subsequent differentiation that occurs during muscle regeneration can be recapitulated ex vivo by isolation of single myofibers from skeletal muscles and culturing them under suspension conditions. Here, we describe an improved protocol to evaluate ex vivo satellite cells activation through isolation of single ...
[摘要] 成年骨骼肌再生由被称为卫星细胞的成人干细胞的专门群体协调,其被定位在基底层和肌纤维的质膜之间。在肌肉再生期间发生的卫星细胞激活,增殖和随后分化的过程可以通过从骨骼肌中分离单个肌纤维并在悬浮条件下培养它们而在体外重现。在这里,我们描述了一种改进的协议,通过从小鼠的伸肌腱长肌(EDL)肌肉中分离单个肌纤维来评价离体细胞的活化,并培养和染色肌纤维相关的卫星细胞的标记物自我更新,增殖和分化。 [背景] 虽然骨骼肌是一种完全分化的有丝分裂后组织,但是它保持了内在的能力,以对遗传和获得性肌肉纤维损伤的形式Grand和Rudnicki,2007)。成年人的肌肉再生由称为卫星细胞的干细胞群体介导,所述细胞位于有丝分裂静止状态的肌纤维的基底层和肌纤维膜之间(Le Grand和Rudnicki,2007)。响应于肌肉创伤,卫星细胞变得活化和增殖以产生与预先存在的纤维融合的成肌细胞,并彼此相互修复或产生新的肌纤维。一小部分卫星细胞不分化,而是重新进入静止以维持干细胞库。所有哺乳动物物种的卫星细胞表达配对盒(Pax)转录因子Pax7,其也用作确定与其他生肌因子如MyoD相关的卫星细胞命运的关键标记(Le Grand和Rudnicki,2007; et al。,2006; Kuang and Rudnicki,2008)。 可以通过肌纤维外植体的悬浮培养部分地重现关于卫星细胞活化,增殖和分化的肌肉再生的体内过程(Rosenblatt等人,1995; ...
|
|