| Visualization of RNA 3’ ends in Escherichia coli Using 3’ RACE Combined with Primer Extension
|
|
Author:
Date:
2018-03-05
[Abstract] In this assay, 3’ RACE (Rapid Amplification of cDNA 3’ Ends) followed by PE (primer extension), abbreviated as 3’ RACE-PE is used to identify the mRNA 3’ ends. The following protocol describes the amplification of the mRNA 3’ ends at the galactose operon in E. coli and the corresponding visualization of the PCR products through PE. In PE, the definite primer is 5’ end-labeled using [γ-(32) P] ATP and T4 polynucleotide kinase, which anneals to the specific DNA molecules within the PCR product of the 3’ RACE. The conventional PE can only be used to locate the 5’ end of an mRNA ...
[摘要] 在该测定中，使用缩写为3'RACE-PE的3'RACE（cDNA3'末端快速扩增），随后是PE（引物延伸），以鉴定mRNA3'末端。以下方案描述E中半乳糖操纵子的mRNA 3'末端的扩增。并通过PE对相应的PCR产物进行可视化。在PE中，使用[γ-（32）P] ATP和T4多核苷酸激酶对确定的引物进行5'末端标记，其退火至3'RACE的PCR产物内的特定DNA分子。由于逆转录酶（RTase）仅在5'→3'方向聚合，常规PE只能用于定位mRNA转录物的5'末端。因此，使用Taq聚合酶代替RTase，进行PCR。因此，我们能够使用此测定法定位mRNA的3'末端。通过在变性8％尿素-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶电泳）凝胶中分离DNA产物，可以直接显示和定量3'末端的相对量。 3'末端的确切位置可以通过比较这些最终的DNA产物与相应的DNA测序阶梯进行测序。
【背景】mRNA 3'末端的合成是E中的重要步骤。产生稳定的信使RNA（mRNA）的大肠杆菌。在真核细胞中，mRNA 3'末端形成是通过从内部磷酸二酯键切割，然后加入聚（A）尾;而在原核细胞中，通过终止转录或通过加工初级转录产生mRNA的3'末端（Altman和Robertson，1973; Nudler和Gottesman，2002; Zhao等人，1999年）。因此，分析mRNA ...
|
|
|
| A Bioreactor Method to Generate High-titer, Genetically Stable, Clinical-isolate Human Cytomegalovirus
|
|
Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] Human cytomegalovirus (HCMV) infection is a major cause of morbidity and mortality in transplant patients and a leading cause of congenital birth defects (Saint Louis, 2016). Vaccination and therapeutic studies often require scalable cell culture production of wild type virus, represented by clinical isolates. Obtaining sufficient stocks of wild-type clinical HCMV is often labor intensive and inefficient due to low yield and genetic loss, presenting a barrier to studies of clinical isolates. Here we report a bioreactor method based on continuous infection, where retinal pigment epithelial ...
[摘要] 人类巨细胞病毒（HCMV）感染是移植患者发病率和死亡率的主要原因，并且是先天性先天缺陷的主要原因（Saint Louis，2016）。接种疫苗和治疗性研究通常需要以临床分离物为代表的野生型病毒的可扩展的细胞培养生产。获得充足的野生型临床HCMV库存往往是劳动密集型的，由于产量低和遗传损失效率低下，对临床分离物的研究构成障碍。在这里，我们报告了一种基于连续感染的生物反应器方法，其中在生物反应器中感染粘附到微载体珠上的视网膜色素上皮（ARPE-19）细胞并用于产生维持关键病毒嗜性因子的遗传完整性的高滴度临床分离株HCMV和病毒基因组。在该生物反应器中，通过定期加入未感染的ARPE-19细胞可以维持末期感染，提供了10 7 -10 -8 pfu / ml浓缩的方便的制备TB40 / E IE2-EYFP库存无需日常细胞传代或胰蛋白酶消化。总的来说，与传统的静态培养板相比，这代表病毒产量增加了100倍的100倍，同时需要90％的处理时间。此外，这种连续的感染环境有可能监测感染动态，并可以实时跟踪病毒的进化。
【背景】先天性巨细胞病毒感染是导致出生缺陷的主要原因，仅在美国，每年的直接成本就高达10亿美元，并代表了全球未得到满足的医疗需求（Bristow等人，2011; Griffiths 2013; Manicklal等人，2013; Saint ...
|
|
|
| Evaluation of Angiogenesis Inhibitors Using the HUVEC Fibrin Bead Sprouting Assay
|
|
Author:
Date:
2016-10-05
[Abstract] Angiogenesis, the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, is a critical process that occurs during normal development and tumor formation. Targeting tumor angiogenesis by blocking the activity of vascular endothelial growth factor (VEGF) has demonstrated some clinical benefit; nevertheless there is a great need to target additional angiogenic pathways. We have found that the human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) fibrin bead sprouting assay (FBA) is a robust and predictive in vitro assay to evaluate the activity of angiogenesis inhibitors. Here, we describe an ...
[摘要] 血管发生，来自预先存在的血管的新血管的生长是在正常发育和肿瘤形成期间发生的关键过程。通过阻断血管内皮生长因子（VEGF）的活性靶向肿瘤血管生成已经证明了一些临床益处;然而，非常需要靶向额外的血管生成途径。我们已经发现，人脐静脉内皮细胞（HUVEC）纤维蛋白珠发芽测定（FBA）是评估血管生成抑制剂的活性的稳健的和预测性的体外测定。在这里，我们描述了用于评估血管生成的生物抑制剂和关键终点的自动定量的优化的FBA方案。
[背景] 血管发生，新血管的生长从先前存在的血管，是在伤口愈合和正常发育期间发生的生理过程。血管生成是一个复杂和高度调节的过程，涉及内皮细胞增殖，分化，迁移，基质粘附和细胞间的信号的紧密协调。血管发生也严重参与肿瘤发展和转移。事实上，通过阻断血管内皮生长因子（VEGF）的活性靶向肿瘤血管生成已经证明了临床益处。由于肿瘤最终对VEGF靶向治疗产生抗性，因此非常需要靶向额外的血管生成途径。我们已经发现人脐静脉内皮细胞（HUVEC）纤维蛋白珠发芽测定（FBA）（Nakatsu等人，2007; Nakatsu和Hughes，2008; ...
|
|
|