| Generation of microRNA Sponge Library
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] This protocol describes the generation and functional validation of microRNA (miRNA) sponge or decoy constructs. When expressed from a strong promoter, these transcripts can sequester specific miRNA:RISC complexes, thereby resulting in a derepression of endogenous target mRNA. Hence, cells expressing such sponges display a partial or full miRNA loss-of-function phenotype.
Depending on the sponge sequence, the activity of any miRNA of choice can be inhibited by sponge sequestration, but it should be noted that these constructs do not seem to be specific for one particular miRNA. ...
[摘要] 该协议描述了microRNA（miRNA）海绵或诱饵构建体的产生和功能验证。 当从强启动子表达时，这些转录物可以隔离特定的miRNA：RISC复合物，从而导致内源性靶mRNA的去阻遏。 因此，表达这种海绵的细胞表现出部分或完全的miRNA功能丧失表型。
根据海绵序列的不同，所选择的miRNA的活性可以通过海绵螯合来抑制，但是应该指出，这些构建体对于一种特定的miRNA似乎并不是特异性的。 相反，由种子序列定义的同一家族的所有miRNA将受到影响，尽管程度不同。
【背景】微小RNA（miRNA）是短的非编码RNA，其大小约为21-24个核苷酸，其在转录后沉默哺乳动物中所有蛋白质编码基因的大部分。自从他们发现以来，越来越多的研究已经清楚地将这个监管层确定为几乎所有生理过程的关键要素。在这种情况下并不奇怪，miRNA的异常表达也与几种人类恶性肿瘤包括癌症有因果关系。
使用经典的功能增益方法，早期研究通常利用过表达来评估特定miRNA的功能。然而，与生理环境相比，这可以达到高达100倍或更高的miRNA水平，并且可能产生不一定与miRNA的正常功能相关的表型。
为了避免可能的过度表达伪影的这个显而易见的问题，在过去几年中已经开发了用于体内和体内使用的miRNA抑制的几种技术，从而允许分析一种特定的miRNA或一组miRNA以功能丧失的方式。这些包括例如miRNA诱饵或海绵的表达，通过以序列特异性方式隔离miRNA：RISC复合物来干扰miRNA功能的长转录物（Ebert等人。 ...
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| Adapting the Smart-seq2 Protocol for Robust Single Worm RNA-seq
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Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract] Most nematodes are small worms that lack enough RNA for regular RNA-seq protocols without pooling hundred to thousand of individuals. We have adapted the Smart-seq2 protocol in order to sequence the transcriptome of an individual worm. While developed for individual Steinernema carpocapsae and Caenorhabditis elegans larvae as well as embryos, the protocol should be adaptable for other nematode species and small invertebrates. In addition, we describe how to analyze the RNA-seq results using the Galaxy online environment. We expect that this method will be useful for the ...
[摘要] 大多数线虫是小蠕虫，缺乏足够的RNA用于常规的RNA-seq协议，而没有汇集成千上万的个体。 我们已经调整了Smart-seq2协议来排序单个蠕虫的转录组。 虽然针对Steinernema carpocapsae和Caenorhabditis elegans幼虫以及胚胎开发，但该方案应该适用于其他线虫物种和小无脊椎动物。 另外，我们介绍如何使用Galaxy在线环境分析RNA-seq结果。 我们预计这种方法将有助于研究野生型和突变体背景个体线虫的基因表达差异。
【背景】低输入RNA-seq方案和扩增试剂盒，例如Smart-seq（Takara Bio，USA，Inc）和SuperAmp（Miltenyl Biotec，Inc），已经越来越多地开发和商业化，作为对低输入RNA-基于小组织，单一微生物和单细胞的seq研究。这些研究经常探索并解决特定群体（例如细胞群体，复杂组织或微生物群体）的个体中的异源基因表达。针对微生物（如线虫）的低输入RNA-seq方案的改进和适应将通过允许在单一线虫水平上分析基因表达异质性而极大地有益于线虫领域。在这里，我们已经调整了单细胞RNA-seq方案Smart-seq2（Picelli等人，2013和2014; Trombetta等人，2014），对于单线虫RNA测序。我们成功地在昆虫寄生线虫Steinernema ...
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