| Efficient Generation of Multi-gene Knockout Cell Lines and Patient-derived Xenografts Using Multi-colored Lenti-CRISPR-Cas9
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Author:
Date:
2017-04-05
[Abstract] CRISPR-Cas9 based knockout strategies are increasingly used to analyze gene function. However, redundancies and overlapping functions in biological signaling pathways can call for generating multi-gene knockout cells, which remains a relatively laborious process. Here we detail the application of multi-color LentiCRISPR vectors to simultaneously generate single and multiple knockouts in human cells. We provide a complete protocol, including guide RNA design, LentiCRISPR cloning, viral production and transduction, as well as strategies for sorting and screening knockout cells. The validity of ...
[摘要] 基于CRISPR-Cas9的敲除策略越来越多地用于分析基因功能。然而，生物信号通路中的冗余和重叠功能可能需要产生多基因敲除细胞，这仍然是一个相对费力的过程。在这里，我们详细介绍了多色LentiCRISPR载体在人体细胞中同时产生单次和多次敲除的应用。我们提供了一个完整的方案，包括指导RNA设计，LentiCRISPR克隆，病毒生产和转导，以及排序和筛选敲除细胞的策略。该过程的有效性通过同时删除白血病细胞系中多达四个程序性细胞死亡介质和来自患者来源的急性淋巴细胞白血病异种移植物，其中单细胞克隆是不可行的。该协议允许任何具有基本细胞生物学设备的实验室，生物安全2级设备和荧光激活细胞分选功能，可在一个月内有效产生单基因和多基因敲除细胞系或原代细胞。
从对细菌基因组中被称为聚簇定期交织的短回文重复（CRISPR）的遗传元件的好奇的初步观察开始（Ishino等人，1987; Mojica等人，2000 ）和随后在哺乳动物细胞中的基因编辑（Cong等人，2013; Mali等人，2013），CRISPR-Cas9已经成为廉价和有效的基因编辑。随着从烟草植物细胞到斑马鱼和原代人类细胞（Hsu等人，2014）的细胞系统的成功应用，CRISPR-Cas9可以通过短的20个核苷酸RNA序列的设计来引导在大基因组内的靶向DNA双链断裂（DSB）（Park等人，2016）。 ...
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| Quantitative Measurements of HIV-1 and Dextran Capture by Human Monocyte-derived Dendritic Cells (MDDCs)
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Author:
Date:
2016-11-20
[Abstract] The aim of this protocol is to describe how to measure and quantify the amount of HIV-1 particles and dextran molecules internalized in human monocyte derived dendritic cells (MDDCs), using three different techniques: flow cytometry, quantitative PCR and confocal microscopy.
[摘要] 本协议的目的是描述如何使用三种不同的技术：流式细胞术，定量PCR和共聚焦显微镜来测量和量化人类单核细胞衍生树突细胞（MDDCs）中内在的HIV-1颗粒和葡聚糖分子的量。
[背景] 开发此协议是为了评估在人单核细胞衍生的树突细胞中肌动蛋白成核破坏时HIV-1内化的变化。在shRNA筛选后，识别对于HIV-1从树突状细胞转移到T细胞重要的基因，我们观察到肌动蛋白成核的中断导致从富含肌动蛋白的树突到水泡的转变，由于过量的肌动球蛋白收缩。结果，观察到HIV-1转移的减少和由于水泡收缩驱动的巨噬细胞增多引起的HIV-1内化的增加。我们的结论是，肌动蛋白成核和稳定的效应器是维持艾滋病毒1对肌动蛋白丰富的树突和限制其内吞作用，有效转移到T淋巴细胞的关键（Menager和Littman，2016）。
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| Isolation and Immortalization of Fibroblasts from Different Tumoral Stages
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Author:
Date:
2014-04-05
[Abstract] Tumour microenvironment and cancer-associated fibroblasts in particular exhibit tumour promoting abilities that are not present in their normal counterparts (Calvo et al., 2013; Hanahan and Coussens, 2012). Therefore, functional and molecular characterization of the modifications occurring in fibroblasts during tumour progression is essential to fully understand their role in tumour progression. Previous studies have addressed this issue using human fibroblasts and comparing normal and adjacent fibroblasts to tumour-associated fibroblasts (Kalluri and Zeisberg, 2006). However, ...
[摘要] 肿瘤微环境和癌相关成纤维细胞特别表现出其正常对应物中不存在的肿瘤促进能力（Calvo等人，2013; Hanahan和Coussens，2012）。因此，在肿瘤进展期间发生在成纤维细胞中的修饰的功能和分子表征是完全理解它们在肿瘤进展中的作用所必需的。以前的研究已经解决了这个问题使用人类成纤维细胞和比较正常和相邻成纤维细胞与肿瘤相关的成纤维细胞（Kalluri和Zeisberg，2006）。然而，这些研究受到人类样品的内在变异性（例如配对，年龄，基因组景观，等）的阻碍。为了克服这些问题，我们使用了完全表征的小鼠乳腺癌模型MMTV-PyMT（Guy等人，1992; Lin等人，2003）。 MMTV-PyMT转基因小鼠在小鼠乳腺肿瘤病毒启动子/增强子的指导下表达多瘤病毒中T抗原。这是一个多焦点管腔乳腺癌模型，经历良好定义和特征阶段（即增生，腺瘤，癌和浸润性癌）。有趣的是，这种模型有100％的发病率，是非常结构性的（呈现高浓度的成纤维细胞），并引起肺自发转移80-94％的发病率。重要的是，至少对于腹股沟乳腺（腺4和9），不同的肿瘤阶段与小鼠的年龄很好相关：在6周龄时出现的增生，6-8周龄之间的腺瘤，癌和侵袭性癌症从8周开始。该模型使我们可靠地分离来自不同肿瘤阶段的成纤维细胞，并仔细表征其功能和分子性质（Calvo等人，2013）。
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