| Analyzing (Re)Capping of mRNA Using Transcript Specific 5' End Sequencing
|
|
Author:
Date:
2020-10-20
[Abstract] The 5′ cap is a ubiquitous feature of eukaryotic mRNAs. It is added in the nucleus onto newly synthesized pre-mRNA, and in the cytoplasm onto mRNAs after decapping or endonuclease cleavage. Cytoplasmic recapping can occur after loss of the cap at the native 5′ end, or downstream within the body of the mRNA. The identification and location of recapping events is key to understanding the functional consequences of this process. Here we present an approach that addresses this problem, using the Lexogen TeloPrime® cDNA synthesis kit to tag recapped 5′ ends. TeloPrime uses a proprietary ...
[摘要] [摘要]5′cap是真核mRNAs普遍存在的特征。它被添加到新合成的pre-mRNA的细胞核中，并在去盖或核酸内切酶切割后加入到mRNAs的细胞质中。细胞质重拾可发生在5′端或mRNA体下游的cap缺失后。识别和定位重述事件是理解该过程的功能后果的关键。这里我们提出了一种解决这个问题的方法，使用Lexogen TeloPrime®cDNA合成试剂盒来标记重述的5′端。TeloPrime使用一种专有的DNA连接酶，在cDNA的3′端加入一个双链DNA寡核苷酸，同时与mRNA碱基配对。寡核苷酸在mRNA 5′端有一个与m7G弱碱基配对的不成对C残基。然后用引物对附加的寡核苷酸和感兴趣的mRNA进行双链cDNA的PCR扩增。得到的产物是凝胶纯化和直接测序（如果是单个带）或克隆和测序。连接的寡核苷酸和靶mRNA连接处的序列提供了cap在相应转录物上的位置。此方法适用于所有封顶转录本。它可以与Sanger测序一起用于少量的转录物，也可以用于Illumina库测序。
[背景]N7-甲基鸟苷帽是所有真核mRNAs的一个显著特征。与cap结合的蛋白质在mRNA生命周期的各个阶段发挥作用，包括核加工、输出、翻译和mRNA衰变。5′cap以共转录方式添加到所有mRNAs中，并开发了许多全基因组技术（例如，基因表达的Capped分析，或CAGE）（Morioka等人，2020年），这些技术利用末端末端的鉴定来标记转录起始位点。除了标记转录起始位点外，约25%的笼状标签映射到剪接内含子的下游（Djebali等人，2012年）。生物化学基础的证据来自我们实验室2009年的鉴定：一种细胞质复合体能够将N7甲基鸟苷帽恢复到5′-单磷酸末端的转录物上，但不能恢复到5′-羟基末端的转录物上（Otsuka等人，2009年）。细胞质封顶由一种复合酶催化，包括封盖酶（RNGTT）、帽甲基转移酶（RNMT）及其激活亚单位（RAM），以及一种将去盖转录物的5′-单磷酸末端转化为5′-二磷酸底物以进行GMP添加的激酶（Trotman和Schoenberg，2019）。我们的早期工作是基于在GMP添加步骤中阻断细胞质封盖的显性负型封盖酶的使用。该蛋白的表达导致出现许多未封顶的转录本，其末端使用5'-种族定位到下游笼状标签附近（Kiss等人，2015年；Berger等人，2019年）。虽然令人鼓舞，但这种方法有三个主要缺点：a）它需要分离带帽和未封顶的rna，b）它假设未封顶的转录本保持足够稳定，可以被检测到，以及c）它假设以这种方式检测到的未封顶末端经历了有限的额外的核外溶核修剪。 ...
|
|
|
| Structural Analysis of Target Protein by Substituted Cysteine Accessibility Method
|
|
Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Substituted Cysteine Accessibility Method (SCAM) is a biochemical approach to investigate the water accessibility or the spatial distance of particular cysteine residues substituted in the target protein. Protein topology and structure can be annotated by labeling with methanethiosulfonate reagents that specifically react with the cysteine residues facing the hydrophilic environment, even within the transmembrane domain. Cysteine crosslinking experiments provide us with information about the distance between two cysteine residues. The combination of these methods enables us to obtain ...
[摘要] 取代半胱氨酸可及性方法（SCAM）是一种生物化学方法，用于研究目标蛋白中取代的特定半胱氨酸残基的水可及性或空间距离。蛋白质拓扑和结构可以通过用甲硫代磺酸盐试剂标记来注释，所述甲硫基磺酸盐试剂特异性地与面向亲水环境的半胱氨酸残基反应，甚至在跨膜结构域内。半胱氨酸交联实验为我们提供了关于两个半胱氨酸残基之间距离的信息。这些方法的组合使我们能够获得有关靶蛋白结构变化的信息。在这里，我们描述了使用SCAM进行结构分析的详细协议。
【背景】结构分析提供了关于靶蛋白功能的关键信息。 X射线晶体学和核磁共振已被用作生物学领域中的高分辨率蛋白质结构分析方法。然而，这些方法需要以非常高的浓度从膜中提取的纯化蛋白质用于膜蛋白的结构分析。取代半胱氨酸可及性方法（SCAM）是一种生化方法，用于分析目标蛋白中取代的特定半胱氨酸残基的水可及性和空间距离。使用特异性地与面向亲水环境的半胱氨酸残基反应的甲硫代磺酸盐（MTS）试剂，我们可以注释目标蛋白的拓扑结构和结构。由于标记试剂 N - 生物素氨基乙基甲硫基磺酸盐（MTSEA-生物素）对质膜是不可渗透的（Seal et ...
|
|
|
| RNA Cap Methyltransferase Activity Assay
|
|
Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Methyltransferases that methylate the guanine-N7 position of the mRNA 5’ cap structure are ubiquitous among eukaryotes and commonly encoded by viruses. Here we provide a detailed protocol for the biochemical analysis of RNA cap methyltransferase activity of biological samples. This assay involves incubation of cap-methyltransferase-containing samples with a [32P]G-capped RNA substrate and S-adenosylmethionine (SAM) to produce RNAs with N7-methylated caps. The extent of cap methylation is then determined by P1 nuclease digestion, thin-layer chromatography (TLC), and phosphorimaging. ...
[摘要] 甲基化mRNA 5'帽结构的鸟嘌呤-N7位置的甲基转移酶在真核生物中普遍存在并且通常由病毒编码。这里我们提供生物样品的RNA帽甲基转移酶活性的生化分析的详细方案。该测定包括将含有帽 - 甲基转移酶的样品与[32 P] G-加帽的RNA底物和S-腺苷甲硫氨酸（SAM）温育以产生具有N7-甲基化帽的RNA。然后通过P1核酸酶消化，薄层色谱（TLC）和磷成像确定帽甲基化的程度。此处描述的方案包括用于产生[32 P] G-加帽的RNA底物和用于从哺乳动物细胞制备核和细胞质提取物的附加步骤。该分析也适用于分析其他生物样品（包括重组蛋白制剂和来自分析分离和免疫沉淀/下拉实验的级分）的帽甲基转移酶活性。
【背景】mRNA的5'端的N7-甲基鸟苷帽是适当的真核mRNA加工，定位和翻译所必需的修饰。 ...
|
|
|