| CRISPR/Cas Gene Editing of a Large DNA Virus: African Swine Fever Virus
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Gene editing of large DNA viruses, such as African swine fever virus (ASFV), has traditionally relied on homologous recombination of a donor plasmid consisting of a reporter cassette with surrounding homologous viral DNA. However, this homologous recombination resulting in the desired modified virus is a rare event. We recently reported the use of CRISPR/Cas9 to edit ASFV. The use of CRISPR/Cas9 to modify the African swine fever virus genome resulted in a fast and relatively easy way to introduce genetic changes. To accomplish this goal we first infect primary swine macrophages with a field ...
[摘要] 大型DNA病毒（例如非洲猪瘟病毒（ASFV））的基因编辑传统上依赖于由报道盒组成的供体质粒与周围同源病毒DNA的同源重组。然而，这种导致所需修饰病毒的同源重组是罕见的事件。我们最近报道了使用CRISPR / Cas9编辑ASFV。使用CRISPR / Cas9修饰非洲猪瘟病毒基因组导致了引入遗传变化的快速且相对简单的方法。为了实现这一目标，我们首先用田间分离株ASFV-G感染原代猪巨噬细胞，并用CRISPR / Cas9供体质粒转染质粒，该质粒将表达靶向我们基因的特异性gRNA被删除。通过插入报告盒，我们能够通过有限稀释和噬菌斑纯化从亲本中纯化我们的重组病毒。我们以前曾报道将传统的同源重组方法与CRISPR / Cas9进行比较，结果导致重组增加超过4个对数。
【背景】 非洲猪瘟（ASF）是一种由ASF病毒（ASFV）引起的高度致命的猪传染性病毒性疾病。 ASFV的基因组由大约180-190千碱基对的双链DNA基因组组成。 ASFV引起一系列疾病，从高度致命到亚临床，取决于宿主特征和病毒株（Tulman et al。，2009）。 ASFV没有商业疫苗;实验上，2007年格鲁吉亚爆发的唯一能够抵御目前流行病毒株的疫苗（ASFV-G）是含有一个或多个病毒基因组缺失的减毒活疫苗，例如:( O'Donnell et ...
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| 3D Culture Protocol for Testing Gene Knockdown Efficiency and Cell Line Derivation
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] Traditional 2D cell cultures with cells grown as monolayers on solid surface still represent the standard method in cancer research for drug testing. Cells grown in 2D cultures, however, lack relevant cell-matrix and cell-cell interactions and ignore the true three-dimensional anatomy of solid tumors. Cells cultured in 2D can also undergo cytoskeletal rearrangements and acquire artificial polarity associated with aberrant gene expression (Edmondson et al., 2014). 3D culture systems that better mimic the in vivo situation have been developed recently. 3D in vitro ...
[摘要] 细胞在固体表面生长为单层的传统二维细胞培养仍然代表了药物检测癌症研究的标准方法。然而，在2D培养物中生长的细胞缺乏相关的细胞基质和细胞 - 细胞相互作用，并且忽略实体肿瘤的真实三维解剖结构。在2D中培养的细胞也可经历细胞骨架重排并获得与异常基因表达相关的人造极性（Edmondson等人，2014）。最近开发出更好地模拟体内情况的3D文化系统。用于研究癌症干细胞的3D体外肿瘤模型（肿瘤球体）在该领域已经获得了越来越多的普及（Weiswald等人，2015）。使用基质嵌入或封装的球体，悬滴培养的球体，磁悬浮系统或3D打印方法的系统已经广泛用于研究和新药筛选。在本文中，我们描述了测试shRNA介导的基因沉默对肿瘤球体形成和生长的影响的详细方案。这种方法允许研究人员测试基因敲低对肿瘤起始细胞生长的影响。正如我们实验室所证实的那样，该方案也可用于直接从肿瘤组织中分离3D癌细胞系。
【背景】3D体外肿瘤细胞模型代表了细胞系与体内生长的肿瘤之间的桥接实验方法（Pampaloni等人，2007; ...
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| Isolation and Establishment of Mesenchymal Stem Cells from Wharton’s Jelly of Human Umbilical Cord
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Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract] Mesenchymal stem cells (MSCs) are currently considered as ‘medicinal signaling cells’ and a promising resource in regard to cell-based regenerative therapy. Umbilical cord is a human term perinatal tissue which is easily attainable, and a promising source of stem cells with no associated ethical concerns. MSCs have been isolated from different regions of the umbilical cord and Wharton’s jelly (WJ) is the gelatinous matrix that surrounds and provides protection to the umbilical cord blood vessels. Being more primitive, MSCs from human umbilical cord exhibit greater proliferative capacity and ...
[摘要] 间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）目前被认为是“医药信号传导细胞”，在基于细胞的再生治疗方面是一种很有前景的资源。脐带是人类的围产期组织，很容易实现，是一种有前途的干细胞来源，没有相关的伦理问题。 MSC已经从脐带的不同区域分离出来，而Wharton's果冻（WJ）是包围并提供对脐带血管的保护的凝胶状基质。更原始的是，与成人干细胞相比，来自人脐带的MSC表现出更大的增殖能力和免疫抑制能力，这使其具有治疗优势。为了满足细胞疗法的要求，通过遵循不耗时或劳动强度的步骤来产生临床规模的MSC是重要的。在此我们提出了一种简单，高效的方法，通过外植体培养方法从人脐带WJ中分离出MSC，这种方法具有重现性和成本效益。
【背景】间充质干细胞（MSC）具有显着的临床潜力来治疗各种衰弱性疾病，主要是由于其独特的免疫调节作用和再生能力（Caplan and Sorrell，2015）。它们存在于许多组织中（Hass et al。，2011），并被观察到是血管周围的体内（Caplan和Correa，2011）。来源或来源本身的小生境可能导致各种MSC类型之间的重要功能差异（Kwon等人，2016年）。虽然骨髓是研究得最充分和最好的MSCs来源，但也有一定的局限性（Liu et al。，2016）。 ...
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