| Quantification of Salicylic Acid (SA) and SA-glucosides in Arabidopsis thaliana
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Author:
Date:
2018-05-20
[Abstract] Homeostasis between the cytoplasmic plant hormone salicylic acid (SA) and its’ inactive, vacuolar storage forms, SA-2-O-β-D-glucoside (SAG) and SA-β-D-Glucose Ester (SGE), regulates the fine-tuning of defense responses to biotrophic pathogens in Arabidopsis thaliana. This protocol describes a simplified, optimized procedure to extract and quantify free SA and total hydrolyzable SA in plant tissues using a classical HPLC-based method.
[摘要] 细胞质植物激素水杨酸（SA）与其无活性的液泡形式，SA-2-葡萄糖苷（SAG）和SA-β-D-葡萄糖酯之间的稳态 （SGE）规定了拟南芥中对营养性病原体防御反应的微调。 该协议描述了一种简化的优化程序，使用传统的基于HPLC的方法提取和定量植物组织中的游离SA和总可水解SA。
【背景】SA（2-羟基苯甲酸）是植物激素，其在叶绿体中响应于病原体攻击而合成。然后输出到细胞质中，在细胞质中建立局部和系统获得性抗性（SAR）。在广义方案中，植物对生物营养性病原体的抗性被认为是通过SA信号传导介导的，而对于坏死性病原体的抗性受茉莉酸（JA）和乙烯（ET）控制。 SA和JA / ET信号通路相互作用。 SA积累到高浓度是有毒的并导致细胞和组织损伤。因此，大多数病原体诱导的SA被UDP-葡糖基转移酶（UGT）糖基化以形成亲水的，无毒的SAG和SGE（Noutoshi等人，2012; George Thompson等人， 2017）。然后将SAG和SGE隔离在液泡中，在那里它们形成水解成活性SA的可重复使用的来源。因此，植物组织中增加的总SA（SA + SAG / ...
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| In vitro AMPylation Assays Using Purified, Recombinant Proteins
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Author:
Date:
2017-07-20
[Abstract] Post-translational protein modifications (PTMs) orchestrate the activity of individual proteins and ensure their proper function. While modifications such as phosphorylation or glycosylation are well understood, more unusual modifications, including nitrosylation or AMPylation remain comparatively poorly characterized. Research on protein AMPylation–which refers to the covalent addition of an AMP moiety to the side chains of serine, threonine or tyrosine–has undergone a renaissance (Yarbrough et al., 2009; Engel et al., 2012; Ham et al., 2014; Woolery et al., ...
[摘要] 翻译后蛋白质修饰（PTM）协调各种蛋白质的活性并确保其功能正常。虽然诸如磷酸化或糖基化的修饰被很好地理解，但是更不寻常的修饰，包括亚硝基化或AMP化仍然比较差的表征。关于蛋白质AMP化的研究 - 其是将AMP部分共价加成到丝氨酸，苏氨酸或酪氨酸的侧链，已经经历了复兴（Yarbrough et al。，2009; Engel et al。 2012年; Ham等人，2014年; Woolery等人，2014年; Preissler等人，2015年; ; Sanyal等人，2015; Truttmann等人，2016; Truttmann等人，2017）。鉴定和表征含丝状（fic）结构域的AMPylases引起了对该PTM的新兴趣（Kinch等人，2009; Yarbrough等人，2009）。基于最近的体内和体外研究，我们现在知道分泌的细菌AMPylase共价连接AMP到Rho家族GTP酶的成员，而后生动物AMPylases修饰HSP70家族蛋白在细胞质和内质网（ER）（Itzen等人，2011; Hedberg和Itzen，2015; Truttmann和Ploegh，2017）。认为AMP化学将HSP70置于不能参与蛋白质重折叠反应的引发剂但瞬时失活的状态（Preissler等人，2015）。 ...
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| Extraction and Assays of ADP-glucose Pyrophosphorylase, Soluble Starch Synthase and Granule Bound Starch Synthase from Wheat (Triticum aestivum L.) Grains
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Author:
Date:
2016-09-20
[Abstract] Starch biosynthesis in plants involves a network of enzymes of which adenosine-5’-diphosphoglucose (ADP-glucose) pyrophosphorylase (AGPase, E.C. 2.7.7.27), and soluble and granule bound starch synthases (SSS and GBSS, E.C. 2.4.1.21) play central roles. Here, we outline the protocol for extraction and assay of these enzymes in developing grains of wheat (Triticum aestivum L.). The principle of the assays outlined is based on a coupling enzymatic reactions where the product of the initial reaction is used as a substrate for subsequent reactions in order to generate NADPH, which can be ...
[摘要] 植物中的淀粉生物合成涉及酶的网络，其中腺苷-5'-二磷酸葡萄糖（ADP-葡萄糖）焦磷酸化酶（AGPase，EC 2.7.7.27）和可溶性和颗粒结合的淀粉合酶（SSS和GBSS，EC 2.4.1.21）中心角色。在这里，我们概述了用于提取和测定这些酶在开发小麦谷粒（ Triticum aestivum L）中的方案。概述的测定法的原理基于偶联酶反应，其中初始反应的产物用作随后反应的底物，以便产生NADPH，其可以通过分光光度计容易地测量。该方案不需要昂贵的标记的化学品，并且可以使用通常在生化实验室中发现的设备进行。我们应用这个协议来研究开花后不同时间点小麦籽粒中AGPase，SSS和GBSS活性的动力学。
[背景] 淀粉是一种碳水化合物聚合物由α-1,4-连接的葡萄糖分子组成的线性葡聚糖聚合物和支链淀粉（由α-1,6-糖苷键支化的α-1,4-连接的葡萄糖分子组成的另一种葡聚糖聚合物）。腺苷-5'-二磷酸葡萄糖（ADP-葡萄糖）焦磷酸化酶（AGPase，E.C.2.7.7.27）催化淀粉合成的第一承诺步骤，将葡萄糖-1-磷酸和ATP转化为ADP-葡萄糖和无机焦磷酸（PPi）。 ADP-葡萄糖随后被可溶性淀粉合成酶（SSS）和颗粒结合的淀粉合酶（GBSS）（EC 2.4.1.21）和淀粉分支酶使用以延长和分支淀粉颗粒的葡聚糖链。 ...
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