| Protein Expression and Purification of the Hsp90-Cdc37-Cdk4 Kinase Complex from Saccharomyces cerevisiae
|
|
Author:
Date:
2017-10-05
[Abstract] Interactions between Hsp90, its co-chaperone Cdc37 and kinases have been biochemically studied for over three decades and have been shown to be functionally important in organisms from yeast to humans. However, formation of a stable complex for structural studies has been elusive. In this protocol we describe expression and purification of Hsp90-Cdc37-Cdk4 kinase protein complex from Saccharomyces cerevisiae utilizing the viral 2A sequences to titrate the three proteins at similar levels.
[摘要] Hsp90，其伴侣伴侣Cdc37和激酶之间的相互作用已经在三十多年的生物化学研究中被证明在酵母与人类的生物体内在功能上是重要的。 然而，形成一个稳定的结构研究复合物是难以捉摸的。 在该方案中，我们描述了利用病毒2A序列以相似水平滴定三种蛋白质的来自酿酒酵母的Hsp90-Cdc37-Cdk4激酶蛋白复合物的表达和纯化。
【背景】Hsp90分子伴侣与其客体激酶之间的稳定形成复合物已经被证明在体外是难治性的。以前的工作表明，Hsp90的共伴伴Cdc37与昆虫Sf9细胞中的客体激酶的过表达导致Sf9 Hsp90，外源Cdc37和外源激酶（Vaughan等人，2006）之间的稳定复合物。然而，昆虫细胞培养需要特殊的设备，比其他研究较好的表达系统（如细菌和酵母）要难以进行遗传操作，并且显着较慢地生长和克隆。上述蛋白质在E中的共表达。大肠杆菌不产生可溶性激酶/稳定复合物。我们认为，酿酒酵母将具有必要的机制来帮助折叠和促进复合物的形成，并试图通过共同表达这些蛋白质来产生人Hsp90β，人Cdc37和人Cdk4激酶之间的复合物， S上。酵母。为了获得三种蛋白质的化学计量表达，我们利用病毒2A肽，其允许三个蛋白质在一个mRNA上转录，随后在翻译阶段切割。该系统已被用于人类细胞系和兔网状细胞（Kim等人，2011; ...
|
|
|
| Characterization of HBV Isolates from Patient Serum Samples and Cloning
|
|
Author:
Date:
2015-12-20
[Abstract] Hepatitis B virus (HBV) mutants can lead to vaccine failure, diagnostic failure of HBV detection, increase viral replication and resistance to antiviral agents. To study the biological characteristics of these mutations may contribute to our knowledge on viral pathogenesis. Therefore, it is essential to isolate and characterize HBV strains from patients. Here we describe the experimental methods to isolate and clone HBV DNA from patient serum. The method will facilitate isolation and functional analysis of new HBV variants.
[摘要] 乙型肝炎病毒（HBV）突变体可导致疫苗失败，HBV检测的诊断失败，增加病毒复制和对抗病毒剂的抗性。 研究这些突变的生物学特性可能有助于我们对病毒发病机制的了解。 因此，必须从患者中分离和表征HBV病毒株。 在这里我们描述从患者血清中分离和克隆HBV DNA的实验方法。 该方法将促进新的HBV变体的分离和功能分析。
|
|
|