| Generation of microRNA Sponge Library
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Author:
Date:
2018-04-20
[Abstract] This protocol describes the generation and functional validation of microRNA (miRNA) sponge or decoy constructs. When expressed from a strong promoter, these transcripts can sequester specific miRNA:RISC complexes, thereby resulting in a derepression of endogenous target mRNA. Hence, cells expressing such sponges display a partial or full miRNA loss-of-function phenotype.
Depending on the sponge sequence, the activity of any miRNA of choice can be inhibited by sponge sequestration, but it should be noted that these constructs do not seem to be specific for one particular miRNA. ...
[摘要] 该协议描述了microRNA（miRNA）海绵或诱饵构建体的产生和功能验证。 当从强启动子表达时，这些转录物可以隔离特定的miRNA：RISC复合物，从而导致内源性靶mRNA的去阻遏。 因此，表达这种海绵的细胞表现出部分或完全的miRNA功能丧失表型。
根据海绵序列的不同，所选择的miRNA的活性可以通过海绵螯合来抑制，但是应该指出，这些构建体对于一种特定的miRNA似乎并不是特异性的。 相反，由种子序列定义的同一家族的所有miRNA将受到影响，尽管程度不同。
【背景】微小RNA（miRNA）是短的非编码RNA，其大小约为21-24个核苷酸，其在转录后沉默哺乳动物中所有蛋白质编码基因的大部分。自从他们发现以来，越来越多的研究已经清楚地将这个监管层确定为几乎所有生理过程的关键要素。在这种情况下并不奇怪，miRNA的异常表达也与几种人类恶性肿瘤包括癌症有因果关系。
使用经典的功能增益方法，早期研究通常利用过表达来评估特定miRNA的功能。然而，与生理环境相比，这可以达到高达100倍或更高的miRNA水平，并且可能产生不一定与miRNA的正常功能相关的表型。
为了避免可能的过度表达伪影的这个显而易见的问题，在过去几年中已经开发了用于体内和体内使用的miRNA抑制的几种技术，从而允许分析一种特定的miRNA或一组miRNA以功能丧失的方式。这些包括例如miRNA诱饵或海绵的表达，通过以序列特异性方式隔离miRNA：RISC复合物来干扰miRNA功能的长转录物（Ebert等人。 ...
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| Genome Editing in Diatoms Using CRISPR-Cas to Induce Precise Bi-allelic Deletions
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Author:
Date:
2017-12-05
[Abstract] Genome editing in diatoms has recently been established for the model species Phaeodactylum tricornutum and Thalassiosira pseudonana. The present protocol, although developed for T. pseudonana, can be modified to edit any diatom genome as we utilize the flexible, modular Golden Gate cloning system. The main steps include how to design a construct using Golden Gate cloning for targeting two sites, allowing a precise deletion to be introduced into the target gene. The transformation protocol is explained, as are the methods for screening using band shift assay and/or ...
[摘要] 最近为三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）和海绵假丝酵母（Thalassiosira pseudonana）建立了硅藻基因组编辑。 目前的协议，虽然开发的 T。 pseudonana ，可以修改编辑任何硅藻基因组，因为我们利用灵活，模块化的金门克隆系统。 主要步骤包括如何设计构建使用金门克隆靶向两个网站，允许一个精确的删除被引入目标基因。 解释转化方案，以及使用带移位测定和/或限制性位点丢失进行筛选的方法。
【背景】CRISPR-Cas正在迅速成为分子研究的一个关键方法。基于在细菌和古细菌中发现的病毒防御机制，CRISPR-Cas诱导基因组中精确位置的双链断裂（DSBs）。它涉及使用与CRISPR ...
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| Markerless Gene Editing in the Hyperthermophilic Archaeon Thermococcus kodakarensis
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] The advent of single cell genomics and the continued use of metagenomic profiling in diverse environments has exponentially increased the known diversity of life. The recovered and assembled genomes predict physiology, consortium interactions and gene function, but experimental validation of metabolisms and molecular pathways requires more directed approaches. Gene function–and the correlation between phenotype and genotype is most obviously studied with genetics, and it is therefore critical to develop techniques permitting rapid and facile strain construction. Many new and candidate ...
[摘要] 单细胞基因组学的出现以及在不同环境中宏基因组分析的持续使用已经成倍地增加了已知的生命多样性。恢复和组装的基因组预测生理，财团相互作用和基因功能，但代谢和分子途径的实验验证需要更直接的方法。基因功能 - 表型和基因型之间的相关性用遗传学得到最明显的研究，因此开发允许快速和容易地构建应变的技术是至关重要的。最近已经发现了许多新的和候选的古细菌谱系，但是对古细菌基因组的实验性，遗传途径目前仅限于一些模式生物。操纵这些基因可获得的生物的基因组所获得的结果已经对我们对古菌生理和信息处理系统的理解产生了深远的影响，这些持续的研究也有助于解决生命树的系统发育重建。超嗜热，浮游，海洋异养古细菌Thermococcus kodakarensis已经成为理想的遗传系统，其具有一系列可用于增加或减少编码活性的技术或修饰基因在体内的表达 。我们在这里概述一些技术，可以快速，无标记地删除单个，或者重复删除几个连续的从 T的序列。 kodakarensis 基因组。我们的程序包括构建转化所必需的质粒DNA的细节，所述质粒DNA通过同源重组指导整合到基因组中，鉴定已经整合了质粒序列的菌株（称为中间菌株）和确认质粒切除，导致最终菌株中的目标基因。可以使用几乎相同的程序来修饰而不是删除基因组基因座。
【背景】古细菌常常在看起来荒凉和迅速变化的环境中繁衍生息。古菌基因组的分析揭示了大量的代谢策略，预测了复杂和高度相互依赖的基因表达的调控网络，并揭示了许多基因，其蛋白质和日益稳定的RNA产物缺乏确定的功能。通过遗传操作挑战现有的和定义新的途径的能力已经辅助了古细菌生理学和信息处理系统的去卷积，并且最近开放了古细菌物种到合成和系统级的方法来定义细胞内和细胞间网络。 ...
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