| Retroviral Capsid Core Stability Assay
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Author:
Date:
2018-09-20
[Abstract] Structural stability of the capsid core is a critical parameter for the productive infection of a cell by a retrovirus. Compromised stability can lead to premature core disassembly, exposure of replication intermediates to cytosolic nucleic acid sensors that can trigger innate antiviral responses, and failure to integrate the proviral genome into the host DNA. Thus, core stability is a critical feature of viral replicative fitness. While there are several well-described techniques to assess viral capsid core stability, most are generally time and labor intensive. Recently, our group compared ...
[摘要] 衣壳核心的结构稳定性是逆转录病毒对细胞的生产性感染的关键参数。受损的稳定性可导致核心过早解体，将复制中间体暴露于细胞溶质核酸传感器，其可触发先天的抗病毒反应，并且不能将原病毒基因组整合到宿主DNA中。因此，核心稳定性是病毒复制适应性的关键特征。虽然有几种充分描述的技术来评估病毒衣壳核心稳定性，但大多数通常是时间和劳动密集型的。最近，我们小组使用基于体外洗涤剂的方法结合超速离心法对衣壳测定的流行命运比较了鼠白血病病毒衣壳核心的相对稳定性。我们发现两种方法都得出了类似的结论，尽管第一种方法是比较显示核心稳定性差异的病毒突变体时评估相对衣壳核心稳定性的一种非常简单和快速的方法。
【背景】逆转录病毒已经进化出复制周期，在规避宿主抗病毒反应方面表现优异。逆转录病毒开发的一种策略是将其复制中间体与胞质核酸传感器如cGAS，TREX1，IFI203和DDX41屏蔽起来（Yan et al。，2010; Gao et al。，2013; Lahaye et al。，2013; Stavrou et al。，2015）。在复制过程中，逆转录病毒在细胞质中产生RNA-DNA杂合体和未甲基化的双链前病毒DNA，这是先天免疫传感器的常见靶标（Yan et al。，2010; Gao et al。，2013; Lahaye et ...
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| Mammalian Cell-derived Vesicles for the Isolation of Organelle Specific Transmembrane Proteins to Conduct Single Molecule Studies
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Author:
Date:
2018-05-05
[Abstract] Cell-derived vesicles facilitate the isolation of transmembrane proteins in their physiological membrane maintaining their structural and functional integrity. These vesicles can be generated from different cellular organelles producing, housing, or transporting the proteins. Combined with single-molecule imaging, isolated organelle specific vesicles can be employed to study the trafficking and assembly of the embedded proteins. Here we present a method for organelle specific single molecule imaging via isolation of ER and plasma membrane vesicles from HEK293T cells by employing OptiPrep ...
[摘要] 细胞衍生的囊泡促进跨膜蛋白在其生理膜中的分离，从而维持其结构和功能完整性。 这些囊泡可以由产生，容纳或运输蛋白质的不同细胞器产生。 结合单分子成像，可以使用分离的细胞器特异性囊泡来研究嵌入蛋白质的运输和组装。 在这里，我们提出了一种通过使用OptiPrep梯度和氮气穴通过从HEK293T细胞中分离ER和质膜囊泡来进行细胞器特异性单分子成像的方法。 通过Western印迹验证分离，并使用分离的囊泡进行寡聚受体组装的单分子研究。
【背景】大量的跨膜蛋白通过多个亚基的组装形成，导致复杂的寡聚结构，其可以通常以多种化学计量存在。了解组装中的变化如何改变在不同细胞器中的贩运和本地化对于确定蛋白质的生理作用以及与成熟和运输相关的疾病的连接至关重要。单分子方法可以通过直接测量其化学计量比来更好地理解寡聚蛋白的组装（Ulbrich和Isacoff，2007; Richards等人，2012）。这种方法避免了整体平均，从而提供了所有化学计量的平均状态（Walter and Bustamante，2014）。单分子研究近来已被用于理解大分子的结构和功能特性，包括构象动力学（Tan等人，2014），离子通道门控（Wang等人 ，2016），配体 - 受体相互作用（Moonschi等人，2015）和化学计量组装（Ulbrich和Isacoff，2007; ...
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| Biochemical Analysis of Dimethyl Suberimidate-crosslinked Yeast Nucleosomes
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] Nucleosomes are the fundamental unit of eukaryotic chromosome packaging, comprised of 147 bp of DNA wrapped around two molecules of each of the core histone proteins H2A, H2B, H3, and H4. Nucleosomes are symmetrical, with one axis of symmetry centered on the homodimeric interaction between the C-termini of the H3 molecules. To explore the functional consequences of nucleosome symmetry, we designed an obligate pair of H3 heterodimers, termed H3X and H3Y, allowing us to compare cells with single or double H3 alterations. Our biochemical validation of the heterodimeric X-Y interaction included ...
[摘要] 核小体是真核染色体包装的基本单元，由围绕核心组蛋白H2A，H2B，H3和H4中的每一个的两个分子包裹的147bp DNA组成。 核小体是对称的，一个对称轴以H3分子的C-末端之间的同源二聚体相互作用为中心。 为了探索核小体对称性的功能性后果，我们设计了一对特异性H3异二聚体，称为H3X和H3Y，使我们能够比较具有单一或双重H3改变的细胞。 我们对异二聚体X-Y相互作用的生物化学验证包括使用二甲基琥珀三酸酯（DMS）进行的核内H3交联。 在这里，我们提供了使用DMS来分析酵母核小体的详细方案。
【背景】组蛋白的翻译后修饰影响染色体生物学的各个方面，包括转录，复制，修复和重组。因为核小体包含每个核心组蛋白的两个拷贝，所以修饰可以是对称的（在两个H3尾部上的相同修饰，例如，在核小体内的两个H3尾部上的K27me（Voigt等人
对于单个核小体内H3X-H3Y相互作用的生化验证，我们生成了表达细菌生物素连接酶BirA，N-末端V5-标记的H3X和N-末端生物素接受表位标记的H3Y的酵母菌株（Beckett等人， 1999）。 ...
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