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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] Adeno-associated virus (AAV) is a small single-stranded DNA virus that requires the presence of a helper virus, such as adenovirus or herpes virus, to efficiently replicate its genome. AAV DNA is replicated by a rolling-hairpin mechanism (Ward, 2006), and during replication several DNA intermediates can be detected. This detailed protocol describes how to analyze the AAV DNA intermediates formed during AAV replication using a modified Hirt extract (Hirt, 1967) procedure and Southern blotting (Southern, 1975).
[摘要] 腺相关病毒（AAV）是一种小型单链DNA病毒，需要存在辅助病毒，如腺病毒或疱疹病毒，以有效地复制其基因组。 AAV DNA通过滚转发夹机制（Ward，2006）进行复制，并且在复制期间可以检测出几种DNA中间体。该详细方案描述了如何使用改良的Hirt提取物（Hirt，1967）程序和Southern印迹（Southern，1975）分析在AAV复制期间形成的AAV DNA中间体。
背景 AAV DNA复制通过滚动发夹机制在由AAV和辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒共感染的细胞中进行（Ward，2006）。 AAV DNA由4.7kb的线性DNA分子和倒置的末端重复（ITR）组成，折叠形成T形发夹结构。 3'末端发夹作为AAV DNA复制的引物。这些发夹结构由AAV Rep蛋白再生，允许进一步复制（Im和Muzyczka，1990）。 AAV DNA的+和 - 链都被包装并且是感染性的（Rose等人，1969）。当分析复制AAV DNA时，可以检测到几种复制中间体（Straus等人，1976）。最丰富的复制中间体是由AAV DNA的一个和一个链形成的线性单体双链体分子，其被认为是将包装在预先形成的衣壳中的后代单链分子的直接前体（Straus ，1976）。二聚体复制中间体也是常见的，AAV复制模型与甚至更大的复制中间体相容。 ...
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Author:
Date:
2014-10-20
[Abstract] Cytidine deaminases are enzymes that catalyze the removal of an amino group from cytidine, forming uridine. APOBEC3 (ApolipoproteinB mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide like) proteins are cytidine deaminases that deaminate cytidines in polynucleotides (RNA/DNA), resulting in editing of their target substrates. Mammalian APOBEC3 proteins are an important element in cellular defenses against retrovirus replication, and this “restriction” of retroviral infections is partially due to the cytidine deaminase activity of the APOBEC3.The present protocol (Nair et al., 2014) describes ...
[摘要] 胞苷脱氨酶是催化从胞苷去除氨基从而形成尿苷的酶。 APOBEC3（载脂蛋白B mRNA编辑酶，催化多肽样）蛋白质是在多核苷酸（RNA/DNA）中脱氨基胞苷的胞苷脱氨酶，导致其靶底物的编辑。哺乳动物APOBEC3蛋白是反转录病毒复制的细胞防御中的重要成分，并且这种逆转录病毒感染的"限制"部分是由于APOBEC3的胞苷脱氨酶活性。本方案（Nair等人， 2014）描述了检测小鼠APOBEC3蛋白的脱氨酶活性的测定法，其靶向存在于单链DNA底物中的TCC或TTC基序中的胞苷。简言之，将待测定的蛋白质制备物与含有脱氨靶基序的荧光团标记的寡脱氧核苷酸一起孵育（放射性标记的寡核苷酸底物也已被其他组成功使用）。寡核苷酸中的胞苷脱氨为尿苷;添加尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）催化尿嘧啶和糖之间的N-糖基键的水解，在寡核苷酸中产生无碱基（AB）位点。温碱处理在AB位点切割底物寡核苷酸;通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳从未切割的底物中分离切割的产物，并在荧光扫描仪上观察。
此处描述的协议主要根据Iwatani等人（2006）所描述的协议进行修改。当然，该测定可用于使用含有用于脱氨酶的含有胞苷的靶序列的寡核苷酸检测靶向DNA底物的其他APOBEC3脱氨酶的活性。
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