| Detection of Intracellular Reduced (Catalytically Active) SHP-1 and Analyses of Catalytically Inactive SHP-1 after Oxidation by Pervanadate or H2O2
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Author:
Date:
2018-01-05
[Abstract] Oxidative inactivation of cysteine-dependent Protein Tyrosine Phosphatases (PTPs) by cellular reactive oxygen species (ROS) plays a critical role in regulating signal transduction in multiple cell types. The phosphatase activity of most PTPs depends upon a ‘signature’ cysteine residue within the catalytic domain that is maintained in the de-protonated state at physiological pH rendering it susceptible to ROS-mediated oxidation. Direct and indirect techniques for detection of PTP oxidation have been developed (Karisch and Neel, 2013). To detect catalytically active PTPs, cell lysates are ...
[摘要] 细胞活性氧（ROS）对半胱氨酸依赖性蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）的氧化失活在调节多种细胞类型的信号转导中起关键作用。大多数PTP的磷酸酶活性取决于催化结构域内的“标记”半胱氨酸残基，其在生理pH下保持质子化状态，使其易受ROS介导的氧化。已经开发了用于检测PTP氧化的直接和间接技术（Karisch和Neel，2013）。为了检测催化活性的PTP，用碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素（IAP-生物素）处理细胞裂解物，所述碘乙酰 - 聚乙二醇 - 生物素（IAP-生物素）不可逆地结合还原的（S-5）半胱氨酸硫醇。使用对磺酸（SO 3）特异性的抗体检测用过钒酸盐或H 2 O 2 2处理细胞后SHP-1的不可逆氧化， H）形式的PTP的保守的活性位点半胱氨酸。在该协议中，我们描述了用于检测造血PTP SHP的还原（S ; active）或不可逆氧化（SO 3 H;非活性）形式的方法-1，尽管这种方法适用于任何细胞类型中的任何半胱氨酸依赖性PTP。
【背景】活性氧（ROS）由细胞NADPH氧化酶和线粒体产生。大多数蛋白质酪氨酸磷酸酶（PTP）含有保守的催化半胱氨酸，其具有低的解离常数（pKa），其对ROS的氧化非常敏感（Rudyk和Eaton，2014）。 PTP的ROS失活在许多细胞类型中调节酪氨酸激酶介导的信号传导反应中起重要作用。在用ROS H 2 O ...
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| Streptavidin Bead Pulldown Assay to Determine Protein Homooligomerization
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Author:
Date:
2017-11-20
[Abstract] Pulldown assay is a conventional method to determine protein-protein interactions in vitro. Expressing a protein of interest with two different tags allows testing whether both versions can be captured via one of the two tags as homooligomeric complex. This protocol is based on streptavidin bead capture of a biotinylated protein and co-associated Flag-tagged protein using Streptavidin MagBeads.
[摘要] Pulldown分析是一种常规的方法来确定蛋白质在体外的相互作用。 用两种不同的标签表达感兴趣的蛋白质可以检测两种标签是否可以通过两种标签之一作为同低聚体复合物来捕获。 该方案基于使用链霉抗生物素蛋白MagBeads的链霉抗生物素蛋白珠捕获生物素化蛋白质和共结合Flag标记蛋白质。
【背景】淀粉样前体蛋白（APP）可以通过其大的胞外结构域及其跨膜结构域形成同型二聚体，在生物学功能中起重要作用。 目前的方案已被用于表征APP跨膜C-末端99个氨基酸片段（C99）的同二聚化（Yan等人，2017）。 该检测的基本原理如图1所示：链霉亲和素包被的MagBeads可以捕获生物素化的蛋白质，这可以拉下相互作用蛋白质，并通过抗FLAG抗体检测。
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图1.基于MagBeads的pull-down测定的原理在该特定的方案中，使用生物素化的Avi-标记的C99蛋白和相关的C99-TEV位点-rTA-Flag蛋白质。
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