| Analysis of Pseudomonas aeruginosa c-di-GMP High and Low Subpopulations Using Flow-assisted Cell Sorting (FACS) and Quantitative Reverse Transcriptase PCR (qRT-PCR)
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] Cyclic diguanylate monophosphate (c-di-GMP) is a second messenger signaling molecule that drives the transition from planktonic to the biofilm mode of growth in many bacterial species. Pseudomonas aeruginosa has at least two surface sensing systems that produce c-di-GMP in response to surface attachment, the Wsp and Pil-Chp systems. We recently used a plasmid-based c-di-GMP reporter (pPcdrA::gfp) to describe how the Wsp system generates heterogeneity in surface sensing, resulting in two physiologically distinct subpopulations of cells during early biofilm formation. One subpopulation has ...
[摘要] [摘要]环状双鸟苷酸单磷酸酯（c-di-GMP）是第二个信使信号分子，它驱动许多细菌物种从浮游生物向生物膜生长的转变。铜绿假单胞菌具有至少两个响应于表面附着而产生c-di-GMP的表面传感系统，即Wsp和Pil-Chp系统。我们最近使用了基于质粒的c-di-GMP报告基因（pP cdrA :: gfp ）描述Wsp系统如何在表面感应中产生异质性，从而在早期生物膜形成过程中导致两个生理上不同的细胞亚群。一个亚群的c-di-GMP升高并产生生物膜基质，从而成为最初的微殖民地的奠基人。另一个亚群的c-di-GMP较低，并且具有表面运动性，可以探索表面。在这里，我们描述了一项关键实验的协议，以确认我们在表面传感过程中对c-di-GMP异质性的初步观察：使用流辅助细胞分选（FACS）来分离具有高和低c- di- G的细胞亚群GMP报告基因活性，然后是已知响应于细胞c-di-GMP水平（pelA和pslA ）被转录调控的基因的定量逆转录酶PCR（qRT-PCR ）。该方案可以被其他人修改以分离高c-di-GMP铜绿假单胞菌细胞的亚群，这些亚群在基因上是相同的，但在表型上是不同的，以便将来像我们一样检查特定的mRNA转录本，或者大概用于其他应用如RNAseq，蛋白质组学或TNseq。
图形概要：
[背景]第二信使信号分子环状单鸟苷酸单磷酸酯（c-di-GMP）可使细菌响应环境条件而迅速修饰其细胞表面。双鸟苷酸环化酶（DGC）是含有从两个GTP分子合成c-di-GMP的GGDEF氨基酸序列基序的蛋白质，磷酸二酯酶（PDE）是具有EAL或HD-GYP基序的蛋白，可将c-di-GMP水解为线性pGpG或GMP ...
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| Measurement of Lysosomal Size and Lysosomal Marker Intensities in Adult Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] Assays have been developed to study trafficking in various tissues of Caenorhabditis elegans. Adult C. elegans intestinal cells are large and have extensive endocytic networks, thus making them a good system for deciphering the endocytic pathway using live imaging techniques. However, the presence of auto-fluorescent gut granules in adult intestine can interfere with the signals of endocytic compartment reporters, like GFP. Here we demonstrate a protocol adapted from the original method developed by the Grant laboratory to identify signals from reporters in adult intestinal ...
[摘要] 已经开发了用于研究线虫的各种组织中的贩运的测定法。 成人 C。 线虫肠细胞很大，具有广泛的内吞网络，因此使它们成为使用实时成像技术破译内吞途径的良好系统。 然而，成年肠道中存在自身荧光的肠道颗粒会干扰吞噬细胞记者的信号，如GFP。 在这里，我们展示了一个协议，从格兰特实验室开发的原始方法改编，以确定记者在成人肠细胞的信号。 该方案的目标是识别标记有荧光标记物的内吞室，而在秀丽隐杆线虫成虫肠细胞中没有背景自发荧光消化道颗粒的混杂效应。
【背景】秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）是一种多细胞生物，已被用于研究内吞运输。最初开发了用于研究内吞的试验。线虫卵母细胞，胚胎和体细胞（清道夫细胞）。简而言之，卵母细胞和胚胎中的测定通过在逗号至1.5倍发育阶段测量肠隔室中含有蛋黄 - 蛋白 - 绿色荧光蛋白报道分子（VIT-2 :: GFP）的区室的强度和大小来进行Grant和Hirsh，1999; Schaheen等人，2006a）。在成年人中，在转基因成虫的体细胞中测量了含有GFP的隔室的强度和大小（从体壁肌细胞分泌进入囊泡并由体细胞胞吞）。表达肌肉myo-3 :: ...
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| Preparation of Precisely Oriented Cryosections of Undistorted Drosophila Wing Imaginal Discs for High Resolution Confocal Imaging
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Author:
Date:
2018-02-05
[Abstract] The combination of immunofluorescence and laser scanning confocal microscopy (LSM) is essential to high-resolution detection of molecular distribution in biological specimens. A frequent limitation is the need to image deep inside a tissue or in a specific plane, which may be inaccessible due to tissue size or shape. Recreating high-resolution 3D images is not possible because the point-spread function of light reduces the resolution in the Z-axis about 3-fold, compared to XY, and light scattering obscures signal deep in the tissue. However, the XY plane of interest can be chosen if embedded ...
[摘要] 免疫荧光和激光扫描共聚焦显微镜（LSM）的组合是高分辨率检测生物样品中分子分布的关键。频繁的限制是需要在组织内或在特定的平面深处进行成像，这可能由于组织大小或形状而不可接近。因为与XY相比，光的点扩散函数将Z轴的分辨率降低了约3倍，并且光散射使组织中的深层信号模糊，所以不可能重新创建高分辨率3D图像。然而，如果嵌入的样品在成像之前被精确地定向和切片，则可以选择感兴趣的XY平面（图1）。在这里，我们描述的果蝇翅成像光盘的冰冻组织切片的准备，这使得我们能够获得高分辨率的图像，在整个这个折叠上皮的深度。
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图1.上皮结构和未畸变的折叠模式在发育果蝇翅膀的这个冰冻部分的整个深度中都被揭示出来。通过机翼囊横向背腹节。 A.冷冻切片显示贯穿上皮深度的信号的α-连环蛋白（A'，A“，洋红色）的细胞核（A，绿色）和亚细胞分布。基底表面清晰可辨（箭头）。 A是“A的数字增强图像”。 B.在显示为XZ正交视图的自顶向下视图中收集的图像的Z-堆叠揭示了α-连环蛋白（B'，B“）甚至数字增强图像（B”）的细胞核（B）但很少可辨别的细节。未能揭示基底上皮表面（箭头）。 ...
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