| Immunophenotyping and Intracellular Staining of Fixed Whole Blood for Mass Cytometry (CyTOF)
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] In this report, we present the implementation of mass cytometry for intracellular staining using fixed whole blood. In our assay described here, 250 µl of whole blood, is stimulated in vitro with PMA/ionomycin (or left unstimulated), in the presence of secretion inhibitors (brefeldin A and monensin), lysed-fixed using SMART TUBE buffers, barcoded (optional), surface stained, fixed, stained for intracellular markers, fixed and DNA stained. Using 250 µl of whole blood from a healthy donor, we show that the expression of major lineage populations such as T cells, B cells, NK cells and ...
[摘要] [摘要] 在本报告中，我们介绍了使用固定全血在细胞内染色中进行细胞计数的方法。在此处所述的测定中，在存在分泌抑制剂（布雷菲德菌素A和莫能菌素）的情况下，用PMA /离子霉素体外刺激（或不刺激）250 µl全血，使用SMART TUBE缓冲液裂解固定，加条形码（可选） ），表面染色，固定，细胞内标记物染色，固定和DNA染色。使用250微升的全血从健康供体中，我们表明，主要的谱系种群，例如T细胞，B细胞，NK细胞和单核细胞，以及细胞因子，例如CD4的表达+ 和CD8 + IFN γ 和TNF α 多个批次（n = 27）之间的一致性是一致的，变异系数（CV）≤21 ％，这意味着最小的变异性。对于每种主要细胞类型，该百分比报告为单峰百分比。据报道，响应刺激的细胞因子表达的百分比为直接亲代细胞类型的百分比。该方案具有许多好处：从生物学的角度来看，它可以应用于临床研究，尤其是在抽血量有限的情况下。从技术上讲，该协议可适用于条形码，这增加了更均匀的样品染色以及抗体保守性的好处，特别是对于大型研究人群。最后，对于包括当前全球COVID-19大流行在内的涉及传染病的研究，该方案允许在处理和染色之前固定传染性样品，从而降低了生物安全风险。
[背景 ] ...
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| In-vitro GLP-1 Release Assay Using STC-1 Cells
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Author:
Date:
2020-08-20
[Abstract] Enteroendocrine cells (EECs) are known chemosensors in the gastrointestinal (GI) epithelium. They release a diversity of gut hormones in response to various stimuli. Here, we report an in-vitro assay to measure GLP-1 release from cultured murine EEC’s under fatty acid stimulation.
[摘要] [摘要] 肠内分泌细胞（EEC）是胃肠道（GI）上皮中的已知化学传感器。它们响应各种刺激而释放多种肠激素。在这里，我们报告了一种体外测定法，以测量在脂肪酸刺激下培养的鼠EEC中GLP-1的释放。
[背景] 肠上皮是人体与环境之间最大的界面。该界面由单个上皮层组成，包含多个具有独特功能角色的不同细胞类型。与LGR5阳性上皮干细胞不同，肠内分泌细胞（EEC）沿整个胃肠道散布在整个上皮中。EEC通过产生和分泌多种激素，在对营养和其他刺激的反应中起关键作用。传统上，这些细胞是按照荷尔蒙特征来分类的（Nausheen 等人，2013； Latorre 等人，2016； Verhoeckx 等人，2015a），尽管随着单细胞RNA测序的到来，我们逐渐意识到这些细胞中的大多数分泌多种激素（Haber 等人，2017; Billing 等人，2019）。EEC的亚型L细胞由胰高血糖素样肽1和2（GLP-1和GLP-2）的产生定义，也可能分泌YY肽（PYY）和胰岛素样肽5（INSL5） 。大多数L细胞见于回肠末端和结肠，而另一些也见于十二指肠和空肠近端。L细胞表面的受体使它们能够直接感知管腔成分并产生适当的激素反应。L细胞上最显着的营养成分和食物成分受体是经典的味觉受体，游离脂肪酸受体以及蛋白质及其产物的受体（Drucker 和Nauck ，2006年；Furness ...
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| A Quantitative Single-cell Flow Cytometry Assay for Retrograde Membrane Trafficking Using Engineered Cholera Toxin
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] The organization and distribution of proteins, lipids, and nucleic acids in eukaryotic cells is an essential process for cell function. Retrograde trafficking from the plasma membrane to the Golgi and endoplasmic reticulum can greatly modify cell membrane composition and intracellular protein dynamics, and thus typifies a key sorting step. However, methods to efficiently quantify the extent or kinetics of these events are currently limited. Here, we describe a novel quantitative and effectively real-time single-cell flow cytometry assay to directly measure retrograde membrane transport. The ...
[摘要] [摘要]蛋白质、脂类和核酸在真核细胞中的组织和分布是细胞功能的重要过程。从质膜到高尔基体和内质网的逆向运输可以极大地改变细胞膜的组成和细胞内蛋白质的动态变化，因此是一个关键的分选步骤。然而，有效量化这些事件的程度或动力学的方法目前是有限的。在这里，我们描述了一种新的定量和有效的实时单细胞流式细胞术检测直接测量逆行膜转运。这项检测利用了众所周知的霍乱毒素逆行转移的特性，利用裂解荧光蛋白产生了新的工具，用于即时监测细胞内的转移。这种方法将大大扩展研究细胞内膜转运的生物学基础，以及细胞膜转运系统如何适应不同细胞类型和细胞状态的生理需要。
[背景]所有的真核细胞都依赖于它们动态地将分子分类和分离到膜结合的亚细胞器中的能力，以便组织和分配到细胞的特定区域。在这一过程中的一个重要步骤是早期分类内体和跨高尔基网络（TGN）。在从分选内体产生的其他贩运途径中，通过分泌途径到TGN的逆行贩运是一个关键的分选步骤（Johannes和Popoff，2008）。细胞膜蛋白和脂类发生逆向转运。从TGN到内质网（ER）的进一步逆行贩运可通过一些质膜脂质完成，并可巧妙地由几种细菌毒素和病毒协同作用而致病（Cho等人，2012年；Personnic等人，2016年；Williams和Tsai，2016年）。
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