| Intestinal Enteroid Culture for Human Astroviruses
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Author:
Date:
2020-07-20
[Abstract] Human astroviruses (HAstV) are non-enveloped, positive-sense single stranded RNA viruses that typically cause gastroenteritis in children, the elderly and among immunocompromised individuals. Some HAstV species have also been implicated in neurological diseases. It is important to study these viruses to understand the pathogenesis and develop therapeutics. Here we describe HAstV infection in epithelium-only human intestinal enteroids (HIE) isolated from biopsy-derived intestinal crypts. Although different HAstV clades have been propagated in transformed immortalized cell lines such as A549, ...
[摘要] [摘要] 人类星状病毒（HAstV）是一种非包膜，正向单链RNA病毒，通常会导致儿童，老年人和免疫力低下的人群中的肠胃炎。一些HAstV物种也与神经系统疾病有关。研究这些病毒以了解其发病机理并开发治疗方法非常重要。在这里我们描述HAstV感染 从活检来源的肠隐窝中分离出的仅上皮的人肠小肠类固醇（HIE）。尽管已经在转化的永生化细胞系（例如A549，Caco-2，HEK293T和Huh7.5）中繁殖了不同的HAstV进化枝，但我们选择HIE是因为它们可以更好地模仿人的肠道，因此在生理上更相关。此外，HIE支持所有HAstV进化枝的复制，包括临床样品，因此使HIE成为研究HAstV生物学的有价值的潜在通用模型。
[背景] 人类星状病毒（HAstV）是高度流行的肠病毒，会引起从腹泻到脑炎的广泛感染。无症状，全身和肠道外感染很常见（Madeley和Cosgrove 1975；Bosch 等人，2014；Kolawole 等人，2019）。尽管具有医学重要性，但H AstV 是一些特征最弱的肠病毒。目前，已识别出三组人类AstV：经典HAstV和非经典HAstV-MLB（墨尔本），以及HAstV-VA / ...
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| Preparation of HeLa Total Membranes and Assay of Lipid-inhibition of Serine Palmitoyltransferase Activity
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] Serine palmitoyltranferase (SPT) is a pyridoxal 5′ phosphate (PLP)-dependent enzyme that catalyzes the first and rate-limiting step of de novo synthesis of sphingolipids. SPT activity is homeostatically regulated in response to increased levels of sphingolipids. This homeostatic regulation of SPT is mediated through small ER membrane proteins termed the ORMDLs. Here we describe a procedure to assay ORMDL dependent lipid inhibition of SPT activity. The assay of SPT activity using radiolabeled L-serine was developed from the procedure established by the Hornemann laboratory. The ...
[摘要] [摘要] 丝氨酸Palmitoyltranferase （SPT）是吡哆醛5 ' 磷酸（PLP）依赖酶催化第一和限速步骤中从头合成鞘脂。SPT活动是Homeostatically调控响应水平的提高鞘脂。这SPT的稳态调节是通过小ER膜蛋白介导称为ORMDLs。在这里，我们描述了一种方法用放射性标记的L-丝氨酸以测定SPT活性的SPT活性。测定的ORMDL依赖性抑制脂质从由规定的程序被开发Hornemann 实验室。 SPT的活性也可以使用氘化的L-丝氨酸进行测定，但需要进行质谱分析，这会耗费金钱，时间和仪器。可以在细胞和无细胞系统中研究ORMDL依赖性脂质对SPT活性的抑制作用。在这里，我们提供了详细的协议来测量存在短链（C8-神经酰胺）或长链神经酰胺（C24-神经酰胺）时SPT活性。该协议的最大优势之一我们通过在HeLa细胞膜中提供外源鞘氨醇和24：1酰基辅酶A通过内源性神经酰胺合酶生成长链神经酰胺来实现这一目标。需要精密的仪器。
[背景 ] 丝氨酸palmit oyltranferase （SPT）是一种多亚基酶是在真核生物和原核生物一些广泛表达（花田等人，1997; Ikushiro 。等人，2001; Hornemann 等人，2007）.The ...
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| Real-time PCR Analysis of PAMP-induced Marker Gene Expression in Nicotiana benthamiana
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Author:
Date:
2018-10-05
[Abstract] Perception of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) often triggers various innate immune responses in plants. The transcriptional changes of defense-related genes are often used as a marker to assay PAMP-triggered plant immune response. Here we described a protocol to monitor the relative expression level of marker genes in Nicotiana benthamiana upon treatment with PAMPs. The procedure includes leaf treatment using PAMPs, total RNA isolation, cDNA synthesis, quantitative real-time PCR and data analysis. This protocol is applicable to monitor marker gene expression triggered ...
[摘要] 对病原体相关分子模式（PAMP）的感知经常引发植物中的各种先天免疫应答。 防御相关基因的转录变化通常用作测定PAMP触发的植物免疫应答的标记。 在这里，我们描述了一种方案，用于监测用PAMP处理的本塞姆氏烟草中的标记基因的相对表达水平。 该方法包括使用PAMP进行叶处理，总RNA分离，cDNA合成，定量实时PCR和数据分析。 该协议适用于监测 N中不同PAMP触发的标记基因表达。本塞姆氏。
【背景】病原体相关的分子模式，即PAMP，是一类源自病原体的分子，在微生物中相对保守。多个PAMP，如flg22和XEG1（Felix et al。，1999; Ma et al。，2015），已被表征，可通过植物细胞表面定位模式检测 - 识别受体（PRR），从而诱导PAMP引发的免疫（Couto和Zipfel，2016）。 PAMP触发的主要反应之一是与防御相关的制造者基因的激活（Navarro et al。，2004; Zipfel et al。，2006）。 Nicotiana benthamiana 已被广泛用作模型植物，并且对多种PAMP敏感。在 N.宾夕法尼亚，先前发现了标记基因，如 NbCYP71D20 ， NbACRE31 和 NbWRKY22 ，它们在PAMP处理后迅速活化（ Heese et al。，2007; Segonzac et ...
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