| Visualization of RNA at the Single Cell Level by Fluorescent in situ Hybridization Coupled to Flow Cytometry
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] The protocol described here has been developed to detect RNA at the single cell level. Fluorescent probes hybridize to target RNAs and are detected by flow cytometry after multiple amplification steps. Different types of RNA can be detected such as mRNA, long noncoding RNA, viral RNA or telomere RNA and up to 4 different target probes can be used simultaneously. We used this protocol to specifically measure the expression of two transcription factor mRNAs, MAFB and IRF4, in human monocytes.
[摘要] 这里描述的方案已经被开发用于在单细胞水平上检测RNA。 荧光探针与目标RNA杂交，并在多个扩增步骤后通过流式细胞术检测。 可以检测不同类型的RNA，例如mRNA，长的非编码RNA，病毒RNA或端粒RNA，并且可以同时使用多达4种不同的靶探针。 我们使用该方案来特异性测量人单核细胞中两种转录因子mRNA，MAFB和IRF4的表达。
【背景】RT-qPCR是用于轻松评估RNA表达的一种主要技术。将细胞裂解并批量分析。因此，细胞异质性丧失。特别是，使用RT-qPCR来解决是否可以基于RNA的表达来鉴定亚群是不可能的。 RNA荧光原位杂交（FISH）是一种检测单细胞RNA的方法。该技术需要RNA靶标上的荧光探针杂交，然后使用成像系统如共聚焦显微镜检测。但是，这种方法非常耗时，并且可以分析有限数量的单个细胞。
我们通过RT-qPCR证实，在具有M-CSF，IL-4和TNFα的RPMI中培养的人单核细胞在三小时后表达转录因子MAFB和IRF4（Goudot等人，2017）。 MAFB和IRF4分别参与单核细胞向单核细胞衍生的巨噬细胞（mo-mac）和单核细胞衍生的DC（mo-DC）的分化。为了破译单核细胞是否表达两种转录因子，或者如果这种表达是互斥的，我们使用PrimeFlow RNA测定法进行与流式细胞术偶联的原位杂交。
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| DNA Fiber Assay upon Treatment with Ultraviolet Radiations
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] Genome stability is continuously challenged by a wide range of DNA damaging factors. To promote a correct DNA repair and cell survival, cells orchestrate a coordinated and finely tuned cascade of events collectively known as the DNA Damage Response (DDR). Ultra Violet (UV) rays are among the main environmental sources of DNA damage and a well recognized cancer risk factor. UV rays induce the formation of toxic cyclobutane-type pyrimidine dimers (CPD) and [6-4]pyrimidine-pyrimidone (6-4PP) photoproducts which trigger the activation of the intra-S phase cell cycle checkpoint (Kaufmann, 2010) ...
[摘要] 基因组稳定性不断受到DNA损伤因素的广泛影响。为了促进正确的DNA修复和细胞存活，细胞协调统一称为DNA损伤反应（DDR）的协调和精细调整的事件级联。超紫外线（UV）是DNA损伤的主要环境来源之一，也是公认的癌症危险因素。紫外线诱导形成毒性环丁烷型嘧啶二聚体（CPD）和[6-4]嘧啶嘧啶酮（6-4PP）光产物，其触发S期细胞周期检查点的活化（Kaufmann，2010），目的在于防止复制叉崩溃，晚期起火和稳定脆弱场所（Branzei和Foiani，2009）。为了监测响应于UV型C（UVC）暴露的S-S相检查点的激活，DNA纤维测定可用于分析新的起始点和DNA合成速率（Jackson等， ，1998; Merrick等人，2004; Alfano等人，2016）。 DNA纤维测定技术在90年代被设想，然后通过使用并入新生DNA链中的胸苷类似物（如CldU和IdU）进一步开发。通过用这些类似物以连续模式处理细胞，可以通过携带不同荧光团的特异性抗体来观察细胞，可以监测复制叉活性并评估其如何受到紫外辐射或其他试剂的影响。
背景 ...
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| Evaluation of Cross-presentation in Bone Marrow-derived Dendritic Cells in vitro and Splenic Dendritic Cells ex vivo Using Antigen-coated Beads
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Author:
Date:
2016-11-20
[Abstract] Antigen presentation by MHC class I molecules, also referred to as cross-presentation, elicits cytotoxic immune responses. In particular, dendritic cells (DC) are the most proficient cross-presenting cells, since they have developed unique means to control phagocytic and degradative pathways.
This protocol allows the evaluation of antigen cross-presentation both in vitro (by using bone marrow-derived DC) and ex vivo (by purifying CD8+ DC from spleen after incorporation of particulate antigen) using ovalbumin (OVA)-coupled particles. Cross-presentation ...
[摘要] 通过MHC I类分子的抗原呈递，也称为交叉呈递，引起细胞毒性免疫应答。特别地，树突细胞（DC）是最熟练的交叉呈递细胞，因为它们已经开发了控制吞噬和降解途径的独特手段。 <此协议允许在体外（通过使用骨髓衍生的DC）和离体（通过纯化CD8 + ）评价抗原交叉呈递。 （OVA）偶联的颗粒后，来自脾脏的DC/DC结合颗粒抗原）。通过三种不同的读数测量交叉呈递效率：B3Z杂交瘤T细胞系（Karttunen等人，1992）和抗原特异性CD8 + T细胞的刺激OT-I）（Kurts等人，1996），在用羧基荧光素琥珀酰亚胺酯（CFSE）标记它们之后分析CD69表达或OT-I增殖的OT-I活化。通过使用这种方法，我们可以最近显示DCs能够在TLR4结合时瞬时增加交叉表达效率（Alloatti等人，2015）。 [背景] 在小鼠中，抗原呈递细胞（APC）能够吸收外源抗原以加工它们，并将源自这些外源抗原的肽加载到主要组织相容性复合体（MHC）I类分子上。肽-MHC I复合物随后被转运到质膜，在那里它们可以呈递到CD8 + T细胞，从而促进T细胞活化，这被称为交叉呈递（Joffre等人， al 。，2012）。在不同的APC中，树突状细胞（DC）在交叉呈递方面表现优异，并且包含表达XCR1标记的不同亚群，其已经显示非常有效地交叉呈递抗原（即CD8 + 来自脾的DC和来自皮肤和肺的CD103 ...
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