| Creating a RAW264.7 CRISPR-Cas9 Genome Wide Library
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Author:
Date:
2017-05-20
[Abstract] The bacterial clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-Cas9 genome editing tools are used in mammalian cells to knock-out specific genes of interest to elucidate gene function. The CRISPR-Cas9 system requires that the mammalian cell expresses Cas9 endonuclease, guide RNA (gRNA) to lead the endonuclease to the gene of interest, and the PAM sequence that links the Cas9 to the gRNA. CRISPR-Cas9 genome wide libraries are used to screen the effect of each gene in the genome on the cellular phenotype of interest, in an unbiased high-throughput manner. In this protocol, we ...
[摘要] 细菌聚集的定期交织的短回文重复（CRISPR）-Cas9基因组编辑工具用于哺乳动物细胞敲除感兴趣的特定基因以阐明基因功能。 CRISPR-Cas9系统要求哺乳动物细胞表达Cas9核酸内切酶，引导RNA（gRNA）引导内切核酸酶到目的基因，以及连接Cas9与gRNA的PAM序列。使用CRISPR-Cas9基因组宽的文库以无偏倚的高通量方式筛选基因组中每个基因对感兴趣的细胞表型的影响。在本协议中，我们描述了我们在转化的鼠巨噬细胞细胞系（RAW264.7）中创建CRISPR-Cas9基因组文库的方法。我们已经使用该文库来鉴定胱天蛋白酶-11细胞死亡途径中的新型介质（Napier等人，2016）;然而，该文库可用于筛选特定基因在多种鼠巨噬细胞通路中的重要性。
背景 历史上，使用RNA干扰（RNAi）或源自敲除小鼠的细胞，了解特定基因对真核细胞中感兴趣的表型的贡献是可能的。然而，在过去几年中，新的基因组编辑技术CRISPR-Cas9已经允许在真核细胞内容易且有效地产生敲除细胞系和全基因组筛选。 CRISPR-Cas9基因组范围的筛选扩大了哺乳动物遗传学的工具箱和新型蛋白质的鉴定及其对特定表型的贡献。使用这种方法，研究人员已经能够鉴定参与肿瘤生长的新基因（Chen等人，2015; Kiessling等人，2016; Steinhart ...
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| HIV-1 Fusion Assay
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Author:
Date:
2014-08-20
[Abstract] The HIV-1 fusion assay measures all steps in the HIV-1 life cycle up to and including viral fusion. It relies on the incorporation of a β-lactamase–Vpr (BlaM-Vpr) protein chimera into the virion and the subsequent transfer of this chimera into the target cell by fusion (Figure 1). The transfer is monitored by the enzymatic cleavage of CCF2, a fluorescent dye substrate of β-lactamase, loaded into the target cells. Cleavage of the β-lactam ring in CCF2 by β-lactamase changes the fluorescence emission spectrum of the dye from green (520 nm) to blue (447 nm). This change reflects virion fusion ...
[摘要] HIV-1融合测定测量HIV-1生命周期中直至并包括病毒融合的所有步骤。 它依赖于将β-内酰胺酶-Vpr（BlaM-Vpr）蛋白嵌合体并入病毒体中，并且随后通过融合将该嵌合体转移到靶细胞中（图1）。 通过CCF2（一种β-内酰胺酶的荧光染料底物）的酶裂解来监测转移，将其装载到靶细胞中。 β-内酰胺酶在CCF2中的β-内酰胺环的切割将染料的荧光发射光谱从绿色（520nm）改变为蓝色（447nm）。 这种变化反映了病毒体融合，并且可以通过流式细胞术检测（图2）。
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