Centromere Chromosome Orientation Fluorescent in situ Hybridization (Cen-CO-FISH) Detects Sister Chromatid Exchange at the Centromere in Human Cells
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Human centromeres are composed of large tandem arrays of repetitive alpha satellite DNA, which are often sites of aberrant rearrangement in cancers (Mitelman et al., 1997; Padilla-Nash et al., 2001). To date, annotation of the human centromere repetitive sequences remains incomplete, greatly hindering in-depth functional studies of these regions essential for chromosome segregation. In order to monitor sister chromatid exchange happening at the centromere (C-SCE) due to recombination and mutagenic events, I have applied the Chromosome-Orientation Fluorescence in situ ...
[摘要] 人类着丝粒由重复的α卫星DNA的大串联阵列组成,这些细胞通常是癌症中异常重排的位点(Mitelman等人,1997; Padilla-Nash等人 >,2001)。迄今为止,对人类着丝粒重复序列的注释仍然不完整,极大地妨碍了这些区域对染色体分离至关重要的深入功能研究。为了监测由于重组和诱变事件而在着丝粒(C-SCE)上发生姊妹染色单体交换,我将染色体定位荧光原位杂交(CO-FISH)技术应用于着丝粒( Cen-CO-FISH)在人类细胞中的表达。这种基于杂交的方法包括(1)通过单轮复制掺入核苷酸类似物,(2)新合成的DNA链的酶消化和(3)单链探针的后续杂交,在不存在变性步骤的情况下。所产生的信号允许基于DNA的5'-3'方向性差异地标记每个姊妹染色单体,并评估指示C-SCE的异常染色模式。应用于人类着丝粒的Cen-CO-FISH方法揭示,人类着丝粒确实在循环细胞中发生重组,导致C-SCE,并且在经历衰老的癌细胞系和原代细胞中着丝粒不稳定性增强(Giunta和Funabiki,2017)。在这里,我介绍了人类细胞中Cen-CO-FISH方法的制备,实验程序和数据采集的详细方案。它还包括该技术的概念性概述,以及代表性图像和评分准则的示例。 Cen-CO-FISH是促进着丝粒重复探索的有用工具。
【背景】人类基因组计划于2003年标记为完成,但它遗漏了超过10%的人类重复DNA(de ...
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Analysing Temporal Dynamics of T Cell Division in vivo Using Ki67 and BrdU Co-labelling by Flow Cytometry
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Author:
Date:
2017-12-20
[Abstract] This protocol was developed to increase the richness of information available from in vivo T cell proliferation studies. DNA labelling techniques such as BrdU incorporation allow precise control of label administration and withdrawal, so that the division history of a population can be tracked in detail over long timeframes (days-weeks). Ki67 is expressed in the nucleus of dividing cells, and is retained for a short time (3-4 days) after division (Gossel et al., 2017); therefore acting as a molecular clock to identify cells that have recently divided. Combining these two ...
[摘要] 该协议的开发是为了增加从体内T细胞增殖研究中获得的信息的丰富性。 诸如BrdU掺入的DNA标记技术允许精确控制标记施用和撤回,从而可以在很长时间段(日 - 周)内详细地追踪群体的分裂历史。 Ki67在分裂细胞的细胞核中表达,并在分裂后短时间(3-4天)保留(Gossel等人,2017)。 因此充当分子时钟来识别最近分裂的细胞。 将这两种技术结合起来就可以整合来自个体细胞的当前和历史扩散信息。 这个数据随后可以用来通过拟合增殖的数学模型来探测种群动态(Gossel et al。,2017)。
【背景】量化T细胞死亡和分裂的动力学是一个重大的实验和计算挑战,但是这个信息对于我们理解一个健康的免疫系统如何发展和维持至关重要。 T细胞群体动态的体内分析有多种技术,但数据的解释是复杂的,结果可能是模型依赖的(Asquith et al。2002 ; De Boer和Perelson,2013)。许多这些分析基于流式细胞仪读数,通过利用多参数分析的潜力提供获得新颖见解的机会。 BrdU吸收与Ki67表达一起的分析结合是特别有用的,因为每个代表细胞分裂的独特参数。 BrdU是掺入分裂细胞DNA中的胸苷类似物,因此永久标记在标记期间已分裂的细胞(Tough和Sprent,1994; ...
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Isolation, Culture and Differentiation of Adult Hippocampal Precursor Cells
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Author:
Date:
2017-11-05
[Abstract] There are two neurogenic niches in the adult mammalian brain: the subventricular zone of the lateral ventricle and the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus. Cells from these areas can be isolated and maintained in vitro, using two different culture systems to assess their potential regarding proliferation and differentiation in a reductionist model. While the neurosphere assay is primarily performed to directly study the proliferative and differentiation potential of cells in individual brains, the monolayer culture allows single cell analysis in a rather homogeneous ...
[摘要] 成年哺乳动物脑中有两个神经生态位:侧脑室下脑室区和海马齿状回颗粒下区。 来自这些区域的细胞可以在体外分离和维持,使用两种不同的培养系统评估它们在还原模型中的增殖和分化的潜力。 虽然神经球测定主要是为了直接研究个体脑中细胞的增殖和分化潜能,单层培养允许在相当均匀的细胞群中进行单细胞分析。 在这里,我们描述了两个系统中的神经前体细胞的分离,培养方法和分化。
【背景】在哺乳动物脑中,成人神经干细胞存在于两个主要神经生态位中,即海马齿状回(DG)的下颗粒区(SGZ)和室下区(SVZ)的侧脑室,其允许新生神经元成人的大脑。来自神经生态位的神经前体细胞可以在体外分离和培养以模拟细胞过程,尤其是增殖和分化。两种标准培养系统,贴壁单层培养(Palmer等人,1995; Ray等人,1995)和神经球测定(Reynolds和Weiss,1992和1996 )在20世纪90年代被引入,代表了在体外研究神经祖细胞生物学的有价值的工具。
根据研究问题,每个系统都有其优点和缺点,在选择其中一种或另一种培养方法之前应该仔细考虑。在贴壁单层培养中,细胞生长相当孤立,形成更均匀的培养物。单层允许直接调查和监测单细胞水平的神经前体细胞。受控条件下的形态,增殖和分化等特征可以很容易地分析和可视化。然而,与神经球培养物相比,以单层培养的细胞代表更复杂的模型,因为细胞通常以更少的通常存在于细胞壁中的细胞 ...
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