| Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) for Studying Sarcomeric Protein Interactions in Drosophila
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] Protein-protein interactions in Drosophila myofibrils are essential for their function and formation. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is an effective method for studying protein interactions and localization. BiFC relies on the reconstitution of a monomeric fluorescent protein from two half-fragments when in proximity. Two proteins tagged with the different half-fragments emit a fluorescent signal when they are in physical contact, thus revealing a protein interaction and its spatial distribution. Because myofibrils are large networks of interconnected proteins, BIFC ...
[摘要] [摘要] 果蝇肌原纤维中的蛋白质-蛋白质相互作用对其功能和形成至关重要。双分子荧光互补（BiFC ）是研究蛋白质相互作用和定位的一种有效方法。BiFC 依赖于邻近时从两个半片段重构单体荧光蛋白。标记有不同半片段的两种蛋白质在物理接触时会发出荧光信号，从而揭示了蛋白质相互作用及其空间分布。因为肌原纤维相互连接的蛋白质的大型网络中，附设是一种理想的方法来 研究肌原纤维中蛋白质之间的相互作用。在这里，我们提出了一种生成与BiFC 兼容的转基因果蝇的协议，以及一种基于肌原纤维中荧光BiFC 信号的蛋白质-蛋白质相互作用分析方法。我们的方案适用于大多数果蝇蛋白，只需稍加修改即可用于研究任何组织。
[背景] 肉瘤是横纹肌中最小的收缩单位，并沿着肌原纤维的长度以重复的方式延伸（Reedy和Beall，1993）。肉瘤产生肌肉收缩的能力取决于两个肌原纤维成分：细丝和粗丝。肌球蛋白粗丝固定在肌节中心的M线，而肌动蛋白细丝固定在肌节两侧的Z盘上。因此，Z盘对于维持肌原纤维的结构和收缩至关重要，而Z盘无法形成可能导致各种人类肌病的严重缺陷性肌肉表型（Lemke和Schnorrer，2017年）。
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| Purification of RNA Mango Tagged Native RNA-protein Complexes from Cellular Extracts Using TO1-Desthiobiotin Fluorophore Ligand
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] A native purification strategy using RNA Mango for RNA based purification of RNA-protein complexes is described. The RNA Mango aptamer is first genetically engineered into the RNA of interest. RNA Mango containing complexes obtained from cleared cellular native extracts are then immobilized onto TO1-Desthiobiotin saturated streptavidin agarose beads. The beads are washed to remove non-specific complexes and then the RNA Mango containing complexes are eluted by the addition of free biotin to the beads. Since the eluted complexes are native and fluorescent, a second purification step such as ...
[摘要] 描述了使用RNA Mango进行RNA-蛋白质复合物的RNA纯化的天然纯化策略。 RNA芒果适体首先被基因工程改造成感兴趣的RNA。 然后将从清除的细胞天然提取物获得的含有RNA复合物的复合物固定在TO1-Desthiobiotin饱和的链霉亲和素琼脂糖珠上。 洗涤珠粒以去除非特异性复合物，然后通过向珠粒中加入游离生物素来洗脱含RNA芒果的复合物。 由于洗脱的复合物是天然的和荧光的，所以可以容易地添加第二纯化步骤如尺寸排阻色谱，并且通过监测荧光追踪纯化的复合物。 通过这种两步纯化策略产生的高纯度天然复合物可以用于进一步的生物化学表征。
【背景】目前的RNA标签受限于诸如差K ，大尺寸，潜在的生物学干扰或缺乏固有荧光的限制（Panchapakesan等人， 2015年）。 RNA芒果很小，可以简单地整合到茎环结构中，特别是GNRA tetraloops中，它具有生物耐受性，并且最重要的是对其噻唑橙基（TO1）配体TO1-Desthiobiotin（TO1-Dtb）具有高亲和力。 ...
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