| Accurate, Streamlined Analysis of mRNA Translation by Sucrose Gradient Fractionation
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Author:
Date:
2017-10-05
[Abstract] The efficiency with which proteins are produced from mRNA molecules can vary widely across transcripts, cell types, and cellular states. Methods that accurately assay the translational efficiency of mRNAs are critical to gaining a mechanistic understanding of post-transcriptional gene regulation. One way to measure translational efficiency is to determine the number of ribosomes associated with an mRNA molecule, normalized to the length of the coding sequence. The primary method for this analysis of individual mRNAs is sucrose gradient fractionation, which physically separates mRNAs based on ...
[摘要] 从mRNA分子产生蛋白质的效率可以在转录本，细胞类型和细胞状态之间广泛变化。准确测定mRNA翻译效率的方法对获得对转录后基因调控的机理理解至关重要。测量翻译效率的一种方法是确定与mRNA分子相关的核糖体的数目，归一化为编码序列的长度。分析单个mRNA的主要方法是蔗糖梯度分级，其基于结合核糖体的数目物理分离mRNA。在这里，我们描述了精确分析与核糖体的mRNA相关性的简化方案。与以前的方案相比，我们的方法结合内部控制和改进的缓冲条件，共同减少由非特异性mRNA - 核糖体相互作用引起的伪像。此外，我们的直接分数qRT-PCR方案消除了从梯度部分中RNA纯化的需要，这大大减少了所需的手动时间量，并促进了多个条件或基因靶标的并行分析。此外，在该过程中不产生苯酚废物。我们最初开发了协议来研究S-HAC1 mRNA的翻译抑制状态。但是我们还详细介绍了哺乳动物细胞系和组织的适应程序。
【背景】将mRNA翻译成蛋白质是一种高度调节的过程，其可以以不同的速率发生，这取决于基因，细胞环境或环境。翻译起始，延伸和终止的每个步骤可以是最终影响与mRNA相关的核糖体数量的调节点（Dever和Green，2012; ...
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| Single-molecule RNA Fluorescence in situ Hybridization (smFISH) in Caenorhabditis elegans
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Author:
Date:
2017-06-20
[Abstract] Single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a technique to visualize individual RNA molecules using multiple fluorescently-labeled oligonucleotide probes specific to the target RNA (Raj et al., 2008; Lee et al., 2016a). We adapted this technique to visualize RNAs in the C. elegans whole adult worm or its germline, which enabled simultaneous recording of nascent transcripts at active transcription sites and mature mRNAs in the cytoplasm (Lee et al., 2013 and 2016b). Here we describe each step of the smFISH procedure, reagents, ...
[摘要] 单分子RNA荧光原位杂交（smFISH）是使用针对靶RNA特异性的多个荧光标记寡核苷酸探针来观察个体RNA分子的技术（Raj等人，2008; Lee等，2016a）。 我们调整了这种技术可视化线虫整个成虫或其种系中的RNA，其能够同时记录活跃转录位点的新生转录物和细胞质中的成熟mRNA（Lee等，2013和2016b）。 在这里，我们描述针对秀丽隐杆线虫挤压性腺优化的smFISH程序，试剂和显微镜设置的每个步骤。
【背景】smFISH能够在体内直接和精确地定量mRNA。 此外，通过复用smFISH探针，可以在同一细胞中同时测定多个RNA物种。 以前的出版物在线虫中使用了smFISH，但是这些研究使用了宽视野显微镜，其通常具有较低的空间分辨率并需要额外的图像处理（例如，图像去卷积）（Ji和van Oudenaarden，2012）。 在这里，我们描述了针对秀丽隐杆线虫组织优化的smFISH程序。 每个步骤都是详细的，包括使用共焦显微镜来获得精确的测量。 我们的协议最大限度地减少了样品与样品的变异性，并允许精确定量mRNA和新生转录物。
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| Gentamicin Protection Assay to Determine Bacterial Survival within Macrophages
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Author:
Date:
2014-09-20
[Abstract] Macrophages are key cells involved in orchestrating host defense against infections. Here, we describe the protocol for a bacterial killing assay in macrophages that can be adapted to any bacterial pathogen. Using this assay, we analyzed the survival of wild-type and mutant strains of Escherichia coli (E. coli) within RAW 264.7 cells, a widely used macrophage cell line. Bacterial mutants defective in intracellular survival within macrophages can be delineated using this assay.
[摘要] 巨噬细胞是参与编制宿主防御感染的关键细胞。 在这里，我们描述的细菌杀伤测定在巨噬细胞，可以适应任何细菌病原体的协议。 使用该测定，我们分析了广泛使用的巨噬细胞系RAW 264.7细胞内的大肠杆菌（大肠杆菌）的野生型和突变株的存活。 可以使用该测定来描绘巨噬细胞内的细胞内存活缺陷的细菌突变体。
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