| Labelling HaloTag Fusion Proteins with HaloTag Ligand in Living Cells
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Author:
Date:
2017-09-05
[Abstract] HaloTag has been widely used to label proteins in vitro and in vivo (Los et al., 2008). In this protocol, we describe labelling HaloTag-Cbx fusion proteins by HaloTag ligands for live-cell single-molecule imaging (Zhen et al., 2016).
[摘要] HaloTag已广泛用于体外和体内标记蛋白质（Los et al。，2008）。 在本协议中，我们描述了通过HaloTag配体标记HaloTag-Cbx融合蛋白的活细胞单分子成像（Zhen等，2016）。
【背景】生物体的分子过程本质上是动态的。直接观察活细胞中的分子过程对于定量地了解生物系统的功能至关重要。荧光显微镜和荧光标记的最新进展使得能够可视化活细胞中单个单个分子的轨迹，提供有关动态相互作用和生物分子装配的见解（Kusumi等，2014; Liu等，2015; Tatavosian等， 2015; Cuvier和Fierz，2017）。用荧光团对生物分子进行特异性标记是荧光单分子成像的关键。 HaloTag是可以与活细胞中合成染料偶联的自标记标签蛋白（Los et al。，2008）。反应在活细胞中迅速发生，形成的共价键是特异性的和不可逆的。该技术已被用于研究体内遗传信息流，并测定活体哺乳动物细胞中基因调控的动力学（Liu et al。，2015; Zheng and Lavis，2017）。 Janelia FluorTM染料，如Janelia FluorTM ...
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| Protocol for HeLa Cells Infection with Escherichia coli Strains Producing Colibactin and Quantification of the Induced DNA-damage
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Author:
Date:
2017-08-20
[Abstract] Strains of Escherichia coli bearing the pks genomic island synthesize the genotoxin colibactin. Exposure of eukaryotic cells to E. coli producing colibactin induces DNA damages, ultimately leading to cell cycle arrest, senescence and death. Here we describe a simple method to demonstrate the genotoxicity of bacteria producing colibactin following a short infection of cultured mammalian cells with pks+ E. coli.
[摘要] 具有pks基因组岛的大肠杆菌菌株合成基因毒素大肠杆菌素。 将真核细胞暴露于产生大肠杆菌的大肠杆菌诱导DNA损伤，最终导致细胞周期停滞，衰老和死亡。 在这里，我们描述了一种简单的方法来证明在用pks +大肠杆菌培养的哺乳动物细胞的短时间感染后，产生大肠杆菌素的细菌的遗传毒性。
【背景】大肠杆菌素是在大肠杆菌的肠外致病，共生和益生菌菌株中发现的基因毒素（Nougayrede等，2006）。大肠杆菌素也由其他肠杆菌科产生，包括肺炎克雷伯杆菌，产气肠杆菌和柠檬酸杆菌（Putze等人，2009）。大肠杆菌素是通过由多酮酶和非核糖体肽合酶（PKS和NRPS），定制和成熟酶以及外排泵组成的多酶机械合成的聚酮化合物/非核糖体肽杂化化合物（综述：Taieb等人。，2016）。该合成机制编码在52kb的基因组，即'pks'岛上。 Colibactin在感染pks +细菌的真核细胞中诱导DNA损伤。由大肠杆菌素诱导的遗传毒性作用需要活的pks +细菌与真核细胞的直接接触。事实上，杀死的细菌或细菌上清液或裂解物没有观察到遗传毒性作用。因此，为了证明产生大肠杆菌的大肠杆菌的基因毒性，培养的哺乳动物细胞（例如HeLa细胞）在4小时内用活的pks ...
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| Single-molecule Analysis of DNA Replication Dynamics in Budding Yeast and Human Cells by DNA Combing
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Author:
Date:
2017-06-05
[Abstract] The DNA combing method allows the analysis of DNA replication at the level of individual DNA molecules stretched along silane-coated glass coverslips. Before DNA extraction, ongoing DNA synthesis is labeled with halogenated analogues of thymidine. Replication tracks are visualized by immunofluorescence using specific antibodies. Unlike biochemical and NGS-based methods, DNA combing provides unique information on cell-to-cell variations in DNA replication profiles, including initiation and elongation. Finally, this assay can be used to monitor the effect of DNA lesions on fork progression, ...
[摘要] DNA梳理方法允许在沿着硅烷涂覆的玻璃盖玻片拉伸的单个DNA分子的水平上分析DNA复制。在DNA提取前，进行的DNA合成用胸苷的卤化类似物标记。使用特异性抗体通过免疫荧光可视化复制轨迹。与生物化学和基于NGS的方法不同，DNA梳理提供了DNA复制谱中细胞间细胞变化的独特信息，包括引发和延长。最后，该测定可用于监测DNA损伤对叉进展，停止和重新启动的影响。
背景 在称为复制起点的真核染色体上的数千个位点处启动DNA合成。原始激活遵循由检查点激酶和染色质的表观遗传修饰（Prioleau和MacAlpine，2016）控制的定义良好的复制计时程序。复制叉在正常S阶段经常停顿。叉停止是由多个事件引起的，例如DNA损伤，紧密结合的蛋白质复合物和高表达基因的转录（Tourriere和Pasero 2007; Zeman and Cimprich，2013）。真核生物已经制定了不同的策略来应对这种复制压力，包括修复机制来重新启动捕获的叉子和激活休眠复制起源以抢救终末抓捕的叉。
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