| Observing Nutrient Gradients, Gene Expression and Growth Variation Using the "Yeast Machine" Microfluidic Device
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Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] The natural environment of microbial cells like bacteria and yeast is often a complex community in which growth and internal organization reflect morphogenetic processes and interactions that are dependent on spatial position and time. While most of research is performed in simple homogeneous environments (e.g., bulk liquid cultures), which cannot capture full spatiotemporal community dynamics, studying biofilms or colonies is complex and usually does not give access to the spatiotemporal dynamics at single cell level. Here, we detail a protocol for generation of a microfluidic ...
[摘要] [摘要 ] 微生物细胞（如细菌和酵母菌）的自然环境通常是一个复杂的社区，在该社区中，生长和内部组织反映了形态发生过程和相互作用，这些过程和相互作用取决于空间位置和时间。虽然大多数研究是在无法捕获完整时空群落动态的简单同质环境（例如，大量液体培养）中进行的，但研究生物膜或菌落却很复杂，通常无法在单个细胞水平上获得时空动态。在这里，我们详细介绍了一种用于生成微流控设备（“酵母机器”）的协议，该协议带有酵母菌落的长单层阵列，以推进对细胞间代谢相互作用如何影响已定义和可定制的空间尺寸内菌落内部结构的全球了解。以酿酒酵母作为模型酵母系统，我们使用“酵母机器”通过追踪荧光标记的己糖转运蛋白来证明葡萄糖梯度的出现。我们进一步量化了菌落内生长速率的表达空间模式和葡萄糖可利用性调控的其他基因的表达。除此之外，我们显示出氨基酸的梯度也在菌落内形成，潜在地打开了类似的方法来研究许多其他营养物和代谢废物的梯度的时空形成。该方法将来可用于在与生态学和进化有关的单细胞分辨率和时标下，破译其他相同物种或更复杂的多物种系统中的远程代谢相互作用，细胞发育和形态发生之间的相互作用。
[背景 ] ...
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| Preparation of Cell-free Synthesized Proteins Selectively Double Labeled for Single-molecule FRET Studies
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] Single-molecule FRET (smFRET) is a powerful tool to investigate molecular structures and conformational changes of biological molecules. The technique requires protein samples that are site-specifically equipped with a pair of donor and acceptor fluorophores. Here, we present a detailed protocol for preparing double-labeled proteins for smFRET studies. The protocol describes two cell-free approaches to achieve a selective label scheme that allows the highest possible accuracy in inter‐dye distance determination.
[摘要] 单分子FRET（smFRET）是研究生物分子的分子结构和构象变化的有力工具。 该技术需要蛋白质样品，该样品是特定位点配有一对供体和受体荧光团的。 在这里，我们提供了一个制备smFRET研究的双标记蛋白的详细方案。 该协议描述了两种无细胞方法来实现选择性标记方案，其允许在染料间距离确定中具有最高可能的准确性。
【背景】单分子FRET（smFRET）是结构生物学中最重要的工具之一，特别是用于分析蛋白质的结构和功能构象变化（Michalet等人，2006; Roy等人。，2008; Sustarsic和Kapanidis，2015）。然而，smFRET的广泛应用在许多情况下受限于合适的蛋白质样品的精细生产。这些蛋白质需要配备两个荧光团，位点特异性连接在蛋白质结构内的不同位置。
经典的基于细胞的蛋白质生产需要一系列耗时的步骤，可以通过使用无细胞蛋白质合成（CFPS）系统来克服，允许更快且直接地生产和选择适当的双标记蛋白质。此外，CFPS的另一个优点是由于几类蛋白质如蛋白酶或膜蛋白对活细胞或其他原因有毒，难以在细胞中表达，可以在CFPS系统中成功合成。最后，CFPS是专注于光谱技术如smFRET的实验室的理想工具，因为细胞培养不是必需的，并且不必考虑重组生物的安全规定。
尽管smFRET所需的样本量本质上很低，但迄今为止，在smFRET研究中，CFPS尚未被标准地用于生产样本。这主要是由于与基于细胞的系统相比蛋白质产量低得多，并且缺乏适当的无细胞方法，其允许适当量的双标记蛋白质的方便合成。然而，正如我们的小组所表明的那样，得益于更高效的正交标记方案（Sadoine ...
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| Dual-probe RNA FRET-FISH in Yeast
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Author:
Date:
2018-06-05
[Abstract] mRNA Fluorescence In Situ Hybridization (FISH) is a technique commonly used to profile the distribution of transcripts in cells. When combined with the common single molecule technique Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), FISH can also be used to profile the co-expression of nearby sequences in the transcript to measure processes such as alternate initiation or splicing variation of the transcript. Unlike in a conventional FISH method using multiple probes to target a single transcript, FRET is limited to the use of two probes labeled with matched dyes and requires the use ...
[摘要] mRNA荧光原位杂交（FISH）是一种常用于分析细胞中转录物分布的技术。 当与常见的单分子技术荧光共振能量转移（FRET）相结合时，FISH也可用于分析转录本中附近序列的共表达以测量转录本的替代启动或剪接变异等过程。 与使用多个探针靶向单个转录物的常规FISH方法不同，FRET限于使用用匹配染料标记的两个探针，并且需要使用敏化发射。 任何能够灵敏地检测Cy3和Cy5单分子的宽视场显微镜应该能够测量酵母细胞中的FRET。 或者，可以使用FRET-FISH方法明确确定转录本的身份，而不使用其他FISH技术中使用的引导探针组。
【背景】单细胞转录物分布的定量通常通过用多个探针靶向mRNA来实现，以实现可以与非特异性结合的探针区分开的明亮信号（Raj和Tyagi，2010）。但是，在某些情况下，转录本上有特征，例如剪接变体或替代起始位点，这与常规FISH探针组无法区分。这些同种型序列可以具有短的50nt唯一识别序列。使用两种探针，可以使用FRET对定位结合的任一侧，同时定量多达三种mRNA同种型，例如，具有两种探针的同种型（FRET），具有探针1的同种型仅限于探针2的同种型。依赖于单个荧光团或荧光团对需要通过EMCCD进行灵敏检测。而且，可以使用FRET对（Wadsworth等人，2017）来估计没有其他同种型的序列的探针的检测效率。
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