| Immunophenotyping and Intracellular Staining of Fixed Whole Blood for Mass Cytometry (CyTOF)
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] In this report, we present the implementation of mass cytometry for intracellular staining using fixed whole blood. In our assay described here, 250 µl of whole blood, is stimulated in vitro with PMA/ionomycin (or left unstimulated), in the presence of secretion inhibitors (brefeldin A and monensin), lysed-fixed using SMART TUBE buffers, barcoded (optional), surface stained, fixed, stained for intracellular markers, fixed and DNA stained. Using 250 µl of whole blood from a healthy donor, we show that the expression of major lineage populations such as T cells, B cells, NK cells and ...
[摘要] [摘要] 在本报告中，我们介绍了使用固定全血在细胞内染色中进行细胞计数的方法。在此处所述的测定中，在存在分泌抑制剂（布雷菲德菌素A和莫能菌素）的情况下，用PMA /离子霉素体外刺激（或不刺激）250 µl全血，使用SMART TUBE缓冲液裂解固定，加条形码（可选） ），表面染色，固定，细胞内标记物染色，固定和DNA染色。使用250微升的全血从健康供体中，我们表明，主要的谱系种群，例如T细胞，B细胞，NK细胞和单核细胞，以及细胞因子，例如CD4的表达+ 和CD8 + IFN γ 和TNF α 多个批次（n = 27）之间的一致性是一致的，变异系数（CV）≤21 ％，这意味着最小的变异性。对于每种主要细胞类型，该百分比报告为单峰百分比。据报道，响应刺激的细胞因子表达的百分比为直接亲代细胞类型的百分比。该方案具有许多好处：从生物学的角度来看，它可以应用于临床研究，尤其是在抽血量有限的情况下。从技术上讲，该协议可适用于条形码，这增加了更均匀的样品染色以及抗体保守性的好处，特别是对于大型研究人群。最后，对于包括当前全球COVID-19大流行在内的涉及传染病的研究，该方案允许在处理和染色之前固定传染性样品，从而降低了生物安全风险。
[背景 ] ...
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| Preparation of Drosophila Polytene Chromosomes, Followed by Immunofluorescence Analysis of Chromatin Structure by Multi-fluorescence Correlations
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Author:
Date:
2020-07-05
[Abstract] Drosophila larval salivary gland polytene chromosome squashes have been used for decades to analyze genome-wide protein-binding patterns, transcriptional activation processes, and changes in chromatin structure at specific genetic loci. There have been many evolutions of the squashing protocol over the years, with sub-optimal reproducibility and low sample success rate as accepted caveats. However, low sample success rates are an obvious disadvantage when polytene chromosomes are used for more high-throughput approaches, such as genetic or antibody screens, or for experiments ...
[摘要] [摘要] 果蝇几十年来，幼虫唾液腺多线染色体压片被用来分析全基因组蛋白质结合模式、转录激活过程以及特定基因位点染色质结构的变化。在过去的几年中，压榨方案已经有了许多改进，次优的重复性和较低的样本成功率是公认的警告。然而，当多线染色体用于更高通量的方法，如遗传或抗体筛查，或用于需要高质量染色体结构保存的实验时，低样本成功率是一个明显的缺点。在这里，我们提出了一个特别可重复的挤压和荧光染色协议，它可以在扩散良好的染色体上生成高质量的荧光图像。接下来是我们的新的、半自动的MATLAB分析程序，用于以逐像素的方式确定多线染色体上单个位点上感兴趣的荧光信号之间的相关性。在我们的案例中，我们已经用这种方法来评估染色体在基因组位点的变化，这些位点被核孔蛋白的异位靶向。我们的分析程序的使用提高了对染色质结构的变化或染色质的蛋白质补充的无偏结论的能力，而不考虑免疫荧光染色的样本变化。由于它只是基于特定位置的荧光强度的差异，因此所提供的分析程序不局限于对多线染色体的分析，并且可以应用于许多不同的上下文中，其中任何特定位置的荧光信号之间的相关性是感兴趣的。
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| FACS-based Isolation of Neural and Glioma Stem Cell Populations from Fresh Human Tissues Utilizing EGF Ligand
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Author:
Date:
2017-12-20
[Abstract] Direct isolation of human neural and glioma stem cells from fresh tissues permits their biological study without prior culture and may capture novel aspects of their molecular phenotype in their native state. Recently, we demonstrated the ability to prospectively isolate stem cell populations from fresh human germinal matrix and glioblastoma samples, exploiting the ability of cells to bind the Epidermal Growth Factor (EGF) ligand in fluorescence-activated cell sorting (FACS). We demonstrated that FACS-isolated EGF-bound neural and glioblastoma populations encompass the sphere-forming colonies in ...
[摘要] 从新鲜组织中直接分离人类神经和胶质瘤干细胞允许其在没有事先培养的情况下进行生物学研究，并且可以在其天然状态中捕获其分子表型的新方面。最近，我们展示了前瞻性地从新鲜人类生发基质和胶质母细胞瘤样品中分离干细胞群的能力，利用细胞在荧光激活细胞分选（FACS）中结合表皮生长因子（EGF）配体的能力。我们证明FACS分离的EGF结合的神经和成胶质细胞瘤细胞群体在体外包含球体形成的集落，并且能够自我更新和多向分化。在此我们详细描述了具有来自新鲜死亡和手术组织的干细胞特性的EGF-结合（即EGFR +）人类神经和胶质瘤细胞的纯化方法。利用天然配体结合能力前瞻性分离干细胞群的能力为了解非培养条件下的正常和肿瘤细胞生物学打开了新的门，并且适用于在种群和单细胞分辨率下的各种下游分子测序研究。
【背景】由于缺乏通用的神经和神经胶质瘤干细胞标志物（Lathia et al。，2015）以及频繁依赖于培养的细胞，理解人神经和胶质瘤干细胞的内在生物学一直是一个挑战比那些直接从组织分离的。跨膜糖蛋白Prominin或CD133是分离神经（Uchida等，2000）和神经胶质瘤干细胞（GSC）（Singh等，2000）的最好描述和经常使用的干细胞标记物之一。等人，2003; Singh等人，2004; ...
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