| Immunophenotyping and Intracellular Staining of Fixed Whole Blood for Mass Cytometry (CyTOF)
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Author:
Date:
2020-09-05
[Abstract] In this report, we present the implementation of mass cytometry for intracellular staining using fixed whole blood. In our assay described here, 250 µl of whole blood, is stimulated in vitro with PMA/ionomycin (or left unstimulated), in the presence of secretion inhibitors (brefeldin A and monensin), lysed-fixed using SMART TUBE buffers, barcoded (optional), surface stained, fixed, stained for intracellular markers, fixed and DNA stained. Using 250 µl of whole blood from a healthy donor, we show that the expression of major lineage populations such as T cells, B cells, NK cells and ...
[摘要] [摘要] 在本报告中，我们介绍了使用固定全血在细胞内染色中进行细胞计数的方法。在此处所述的测定中，在存在分泌抑制剂（布雷菲德菌素A和莫能菌素）的情况下，用PMA /离子霉素体外刺激（或不刺激）250 µl全血，使用SMART TUBE缓冲液裂解固定，加条形码（可选） ），表面染色，固定，细胞内标记物染色，固定和DNA染色。使用250微升的全血从健康供体中，我们表明，主要的谱系种群，例如T细胞，B细胞，NK细胞和单核细胞，以及细胞因子，例如CD4的表达+ 和CD8 + IFN γ 和TNF α 多个批次（n = 27）之间的一致性是一致的，变异系数（CV）≤21 ％，这意味着最小的变异性。对于每种主要细胞类型，该百分比报告为单峰百分比。据报道，响应刺激的细胞因子表达的百分比为直接亲代细胞类型的百分比。该方案具有许多好处：从生物学的角度来看，它可以应用于临床研究，尤其是在抽血量有限的情况下。从技术上讲，该协议可适用于条形码，这增加了更均匀的样品染色以及抗体保守性的好处，特别是对于大型研究人群。最后，对于包括当前全球COVID-19大流行在内的涉及传染病的研究，该方案允许在处理和染色之前固定传染性样品，从而降低了生物安全风险。
[背景 ] ...
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| Phenotyping of Live Human PBMC using CyTOFTM Mass Cytometry
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Author:
Date:
2015-01-20
[Abstract] Single-cell analysis has become an method of importance in immunology. Fluorescence flow cytometry has been a major player. However, due to issues such as autofluorescence and emission spillover between different fluorophores, alternative techniques are being developed. In recent years, mass cytometry has emerged, wherein antibodies labeled with metal ions are detected by ICP-MS. In order for a cell to be seen, a metal in the mass window must be present; there is no analogous parameter to forward or side scatter. The current mass window selected is approximately AW 103-196, which includes the ...
[摘要] 单细胞分析已成为免疫学中重要的一种方法。荧光流式细胞仪一直是主要的参与者。然而，由于诸如自身荧光和不同荧光团之间的发射溢出的问题，正在开发替代技术。近年来，已经出现了大量细胞计数，其中用金属离子标记的抗体通过ICP-MS检测。为了看到电池，必须存在质量窗口中的金属;没有与前向或侧向散射的类似参数。选择的当前质量窗口大约是AW 103-196，其包括用于大多数抗体标记的镧系元素，以及用于DNA嵌入剂的铱和铑。在本方案中，我们使用用MAXPAR金属标记的抗体混合物螯合聚合物对先前冷冻保存的表面染色活的PBMC。许多这些标记取自标准荧光表型组（Maecker等人，2012）。不使用细胞内抗体。我们使用CyTOF TM （通过飞行时间细胞计数）质谱仪获取ICP-MS数据。使用FlowJo软件的双计数信号数据的后续分析允许基于每个质量通道中的双计数信号来分析细胞类型。确定每种细胞类型的百分比，并报告为父细胞类型的百分比。
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| Intracellular Cytokine Staining on PBMCs Using CyTOFTM Mass Cytometry
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Author:
Date:
2015-01-05
[Abstract] In this protocol, we use a CyTOFTM mass cytometry to collect single-cell data on a large number of cytokines/chemokines as well as cell-surface proteins that characterize T cells and other immune cells. The current selected mass window in AW 103-203 includes the lanthanides used for most antibody labeling, along with iridium and rhodium for DNA intercalators. The output data are in the format as .txt and .fcs files, which is compatible with many analysis programs. This protocol could be adapted to include tetramers into the staining panel, but we have not optimized for that purpose. ...
[摘要] 在这个协议中，我们使用CyTOF TM 质谱仪收集大量细胞因子/趋化因子以及表征T细胞和其他免疫细胞的细胞表面蛋白的单细胞数据。 AW 103-203中当前选择的质量窗口包括用于大多数抗体标记的镧系元素，以及用于DNA嵌入剂的铱和铑。输出数据的格式为.txt和.fcs文件，与许多分析程序兼容。该方案可以适于将四聚体包括在染色板中，但是我们没有为此目的进行优化。细胞内细胞因子染色的主要步骤如下：首先，细胞被活化几小时，使用特异性肽或非特异性活化混合物。加入蛋白质转运抑制剂（例如布雷菲德菌素A）以将细胞因子保留在细胞内。接下来，加入EDTA以从活化容器中除去粘附细胞。洗涤后，将细胞表面标记物的抗体加入细胞中。然后将细胞固定在多聚甲醛中并透化。我们使用温和的洗涤剂皂苷作为渗透缓冲液，因为与苛刻的洗涤剂或甲醇相比，它对表面和细胞内表位的破坏性更小。透化后，将金属缀合的抗细胞因子抗体加入细胞悬浮液中。然后将染色的细胞依次导入质谱仪进行信号强度分析
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