| Affinity Purification of the RNA Degradation Complex, the Exosome, from HEK-293 Cells
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] The RNA exosome complex plays a central role in RNA processing and regulated turnover. Present both in cytoplasm and nucleus, the exosome functions through associations with ribonucleases and various adapter proteins (reviewed in [Kilchert et al., 2016]). The following protocol describes an approach to purify RNA exosome complexes from HEK-293 cells, making use of inducible ectopic expression, affinity capture, and rate-zonal centrifugation. The obtained RNA exosomes have been used successfully for proteomic, structural, and enzymatic studies (Domanski et al., 2016).
[摘要] RNA外植体复合物在RNA加工和调节营养中起核心作用。在细胞质和细胞核中存在，外来体通过与核糖核酸酶和各种衔接蛋白的关联起作用（参见[Kilchert等人，2016]）。以下方案描述了从HEK-293细胞中纯化RNA外来体复合物的方法，利用可诱导的异位表达，亲和力捕获和速率 - 区带离心。所获得的RNA外来体已被成功地用于蛋白质组学，结构和酶学研究（Domanski等人，2016）。
在我们以前的工作中，我们建立了在四环素诱导型CMV启动子（HEK-293 Flp-In T-REx-Thermo Fisher）的控制下表达C末端3xFLAG标记的外来体组分EXOSC10（RRP6）的同基因HEK-293细胞系科学）。该系统允许我们以与内源WT蛋白质相当的水平表达标记的EXOSC10蛋白质，并且使用磁性抗FLAG亲和介质和来源于冷冻细胞粉末的蛋白质提取物来研究外来体纯化方案（Domanski等， / em>。，2012）。进一步探索使用的蛋白质提取条件，我们开发了一种允许在亲和捕获的外来体内保留DIS3（RRP44）的方案，否则证明是困难的（Hakhverdyan等人，2015）。基于这些研究，我们通过使用甘油密度梯度的速率区带离心法进一步纯化了RNA外来体（+/- DIS3）（Domanski等人，2016）。虽然蛋白质提取物中洗涤剂CHAPS（3 - ...
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| RNA Degradation Assay Using RNA Exosome Complexes, Affinity-purified from HEK-293 Cells
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Author:
Date:
2017-04-20
[Abstract] The RNA exosome complex plays a central role in RNA processing and regulated turnover. Present both in cytoplasm and nucleus, the exosome functions through associations with ribonucleases and various adapter proteins (reviewed in [Kilchert et al., 2016]). The RNA exosome-associated EXOSC10 protein is a distributive, 3’-5’ exoribonuclease. The following protocol describes an approach to monitor the ribonucleolytic activity of affinity-purified EXOSC10-containing RNA exosomes, originating from HEK-293 cells, as reported in (Domanski et al., 2016) and further detailed in the ...
[摘要] RNA外植体复合物在RNA加工和调节营养中起核心作用。在细胞质和细胞核中存在，外来体通过与核糖核酸酶和各种衔接蛋白的关联起作用（参见[Kilchert等人，2016]）。 RNA外植体相关的EXOSC10蛋白是分布的3'-5'外核糖核酸酶。以下方案描述了监测源自HEK-293细胞的亲和纯化含EXOSC10的RNA外来体的核糖核酸裂解活性的方法，如（Domanski等人，2016）所报道的，并进一步详细描述这个配套生物协议（Domanski和LaCava，2017）。
在我们以前的工作中，我们在四环素诱导型CMV启动子（HEK-293 Flp-In T-REx-Thermo）的控制下，建立了表达C末端3xFLAG标记的外来体成分EXOSC10（RRP6）的同基因HEK-293细胞系费雪科学）。该系统允许我们以与内源WT蛋白质相当的水平表达标记的EXOSC10蛋白质，并且使用磁性抗FLAG亲和介质和来源于冷冻细胞粉末的蛋白质提取物来研究外来体纯化方案（Domanski等， / ...
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| Sample Preparation of Telomerase Subunits for Crystallization
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Author:
Date:
2015-08-20
[Abstract] Telomerase is a large ribonucleoprotein complex that replicates the linear chromosome ends in most eukaryotes. Large-scale preparation of the telomerase core components in vitro has long been a big challenge in this field, hindering the understanding of the catalytic mechanism of telomerase, as well as slowing down the development of telomerase inhibitors for cancer therapy. We have successfully developed a protocol for large-scale preparation of the TRBD-CR4/5 complex of the medaka telomerase in vitro, and used this method to study the high-resolution structure of the ...
[摘要] 端粒酶是在大多数真核生物中复制线性染色体末端的大核糖核蛋白复合物。 体外大规模制备端粒酶核心组分长期以来一直是该领域的一个大挑战，阻碍了对端粒酶的催化机理的理解，以及减慢端粒酶抑制剂对癌症的发展 治疗。 我们成功地开发了用于大规模制备体外的medaka端粒酶的TRBD-CR4/5复合物的方案，并且使用该方法研究TRBD-CR4/5复合物的高分辨率结构， 5复合物通过X射线晶体学。 该程序也可以适于纯化其它蛋白质-RNA复合物用于结构研究。
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