| A Modified Semisolid Clonal Culture for Identification of B-1 and B-2 Progenitor Colony Forming Ability of Mouse Embryonic Hemogenic Endothelial Cells
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Author:
Date:
2020-05-05
[Abstract] The search for the origin of the first hematopoietic stem cells (HSCs) in the mouse embryo has been a hot topic in the field of developmental hematopoiesis. Detecting lymphoid potential is one of the supportive evidence to show the definitive hematopoietic activity of HSCs. However, the first B-lymphoid potential in the mouse embryos are reported to be biased to innate-like B-1 cell lineage that can develop from hemogenic endothelial cells (HECs) independently of HSCs. On the other hand, conventional adaptive immune B cells (B-2) cells are considered to be exclusively derived from HSCs. ...
[摘要] [摘要 ] 在搜索起源的第一造血干细胞（HSCs）在小鼠胚胎一直是一个热门话题在该领域发展造血功能。检测淋巴潜力是一个支持性证据显示权威造血活动的造血干细胞然而，据报道，小鼠胚胎中的第一个B淋巴样电位偏向于先天性B-1细胞谱系，该谱系可以从造血内皮细胞（HEC）脱离HSC发育而来。 B细胞（B-2）细胞被认为仅来自HSC。因此，分离B-1和B-2祖细胞的潜力对于理解也由HEC通过中间前体（也称为HEC）产生的HSC的发育过程非常重要。 HECs和pre-HSCs均显示pre-HSCs显示内皮表面表型并需要基质支持以检测其造血活性。利用基质细胞培养后再进行改良的半固体克隆培养的方法使我们能够检测B-1的菌落形成单位数量/ B-2祖细胞最初源自HEC / HSC之前的细胞，将反映B-1偏倚或多谱系繁殖的HSC的潜力。
[背景 ] 半固体克隆培养（甲基纤维素集落形成测定法）是检测造血祖细胞数量的传统方法。一个集落被认为是来自单个祖细胞（克隆来源），添加的细胞因子在细胞的形成中起着重要作用。产量菌落，例如Epo增强了红细胞的菌落形成单位（CFU-E）或红细胞的爆发形成单位（BFU-E），而G-CSF / GM-CSF将增强CFU-G（粒细胞），M ...
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| Generating Loss-of-function iPSC Lines with Combined CRISPR Indel Formation and Reprogramming from Human Fibroblasts
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] For both disease and basic science research, loss-of-function (LOF) mutations are vitally important. Herein, we provide a simple stream-lined protocol for generating LOF iPSC lines that circumvents the technical challenges of traditional gene-editing and cloning of established iPSC lines by combining the introduction of the CRISPR vector concurrently with episomal reprogramming plasmids into fibroblasts. Our experiments have produced nearly even numbers of all 3 genotypes in autosomal genes. In addition, we provide a detailed approach for maintaining and genotyping 96-well plates of iPSC ...
[摘要] 对于疾病和基础科学研究而言，功能丧失（LOF）突变是非常重要的。 在这里，我们提供了一个简单的流线化协议来产生LOF iPSC系列，通过将CRISPR载体与附加型重编程质粒同时引入成纤维细胞，规避了传统基因编辑和已建立的iPSC系的克隆的技术挑战。 我们的实验已经产生了常染色体基因中所有3种基因型的几乎偶数。 此外，我们提供了一个详细的方法来维护和iPSC克隆的96孔板的基因分型。
【背景】CRISPR / Cas9技术允许简单且特异地针对特定基因组位置进行基因编辑。将该技术与诱导性多能干细胞（iPSC）的疾病建模和再生医学潜力相结合将继续对生物医学研究产生前所未有的影响。然而，使CRISPR / Cas9系统适应iPSC已经提出了几个挑战。在细胞系中进行基因编辑的传统方法是用表达Cas9蛋白质的质粒和指导RNA（gRNA）转染细胞，然后产生单克隆并筛选所需的遗传改变。不幸的是，iPSC不适用于单细胞克隆。已经开发了几种补充媒介和克隆方法来克服这一困难，但仍然充满昂贵的设备（低氧培养箱），困难的技术步骤（FACS分选的单个iPSC的存活）或劳动密集型方案（亚克隆）（Forsyth ，2006; Miyaoka ...
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| Characterising Maturation of GFP and mCherry of Genomically Integrated Fusions in Saccharomyces cerevisiae
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Author:
Date:
2018-01-20
[Abstract] Single-molecule fluorescence microscopy enables unrivaled sub-cellular quantitation of genomically encoded fusions of native proteins with fluorescent protein reporters. Fluorescent proteins must undergo in vivo maturation after expression before they become photoactive. Maturation effects must be quantified during single-molecule analysis. Here we present a method to characterise maturation of GFP and mCherry genetic protein fusions in budding yeast Saccharomyces cerevisiae.
[摘要] 单分子荧光显微镜技术使天然蛋白与荧光蛋白报告基因的基因组编码融合成为无与伦比的亚细胞定量。 荧光蛋白质在表达后必须进行体内成熟，然后它们变成光敏的。 成熟效应必须在单分子分析过程中进行量化。 在这里，我们提出一种方法来表征GFP和mCherry遗传蛋白融合在芽殖酵母酿酒酵母中的成熟。
【背景】单分子荧光显微技术能够灵敏定量分子化学计量，流动性和拷贝数，不仅在逐个细胞的基础上，而且精确到个别的亚细胞区室（Leake，2012; Wollman和Leake，2015; Shashkova， >等。，2017）。该技术依赖于感兴趣的野生型蛋白质的内源表达的荧光蛋白融合，从而存在一对一的标记。然而，所有荧光蛋白在进入明亮的荧光状态之前的体内成熟时间从几分钟到几十分钟不等（Badrinarayanan等人，2012）。因此，测量任何成熟效应和量化是否存在标记蛋白质的不成熟“暗部分”是最重要的。这些测量也与光漂白（FRAP）后的荧光恢复特别相关。 FRAP可用于研究活细胞中的分子转换（Beattie等人，2017）。 FRAP基于荧光标记组分定位的细胞区域的光漂白，随后定量该区域随时间的任何荧光恢复。可以使用在初始光漂白剂之后作为时间函数的荧光强度之间的测量关系来确定分子迁移率和动力学参数，例如特定荧光组分从分子复合物解离的速率（Leake等人， ...
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