| Fractionation of Ovarian Follicles and in vitro Oocyte Maturation and Ovulation Assay of Ciona intestinalis Type A
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Author:
Date:
2020-04-05
[Abstract] Ascidians are the closest living relatives of vertebrates (Delsuc et al., 2006; Satoh et al., 2014) and are important for the evolutionary study of the ovarian follicle development including oocyte maturation and ovulation. However, neither the endogenous factors nor the molecular mechanisms underlying the oocyte maturation and ovulation had been elucidated mainly due to the lack of efficient procedure for isolating ovarian follicles. Here, we present the protocol for the effective fractionation and isolation of the ovarian follicle of Ciona intestinalis type A ...
[摘要] [摘要 ] 海鞘是脊椎动物的近亲（Delsuc 等，2006； Satoh 等，2014），对于卵巢卵泡发育（包括卵母细胞成熟和排卵）的进化研究具有重要意义。然而，尚未阐明卵母细胞成熟和排卵的内源性因素或分子机制，主要是由于缺乏有效的分离卵泡的程序。在这里，我们介绍了使用不同粒径的不锈钢筛网有效分离和分离A型Ciona 小肠卵巢卵泡的方案，以及Ciona 的简单孵育方法 卵泡用于评估卵母细胞的成熟和排卵。结合每个部分的RNA-seq数据，当前的方法使我们以特定阶段的方式研究包括卵母细胞成熟和排卵在内的卵巢卵泡发育。
[背景 ] Ciona 卵巢卵泡分为四个主要发育阶段：I期（卵黄形成前），II期（卵黄形成），III期（卵黄形成后，GVBD之前）和IV期（GVBD后，排卵）卵泡。 （图1；Prodon 等，2006； Silvestre 等，2009）。成年海鞘的卵巢在整个发育阶段都包含许多卵泡，因此，在特定阶段分离单个卵泡既费时又麻烦。这阻碍了卵泡发育的功能分析，并提示需要有效的卵泡分离方法。在这里，我们提供一种有效的分离方法，每一个developmenta的混合物卵泡的升级可以使用一系列的分馏不锈钢筛具有各种粒度目ES （20-150 μ 米）。当前的分级方法使我们能够轻松快速地分离出卵泡的整个发育阶段。此外，卵母细胞的成熟和排卵可以分别通过生发小泡b ...
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| Lipid Mixing Assay for Murine Myoblast Fusion and Other Slow Cell-cell Fusion Processes
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Author:
Date:
2020-03-05
[Abstract] Lipid mixing (redistribution of lipid probes between fusing membranes) has been widely used to study early stages of relatively fast viral and intracellular fusion processes that take seconds to minutes. Lipid mixing assays are especially important for identification of hemifusion intermediates operationally defined as lipid mixing without content mixing. Due to unsynchronized character and the slow rate of the differentiation processes that prime the cells for cell-cell fusion processes in myogenesis, osteoclastogenesis and placentogenesis, these fusions take days. Application of lipid ...
[摘要]
[摘要 ] 脂质混合（脂质探针在融合膜之间的分布）已广泛用于研究相对快速的病毒和细胞内融合过程的各个阶段，这些过程耗时数秒至数分钟。脂质混合测定对于鉴定在操作上定义为没有内容混合的脂质混合的半融合中间体特别重要。由于不同步的特性以及分化过程的缓慢速度，这些分化过程使细胞在成肌，破骨细胞生成和胎盘生成中引发细胞间的融合过程，因此这些融合需要几天的时间。在这些非常缓慢的融合过程中应用脂质混合测定法检测早期融合中间体时，必须考虑质膜成分的连续转换以及脂质探针在膜之间的潜在融合无关交换。在这里，我们描述了脂质混合分析在骨骼肌细胞发育和再生中成肌融合阶段的工作中的应用。我们的方法利用了基于鼠C2C12细胞的成肌分化和融合的常规体外模型。当我们观察到第一个多核细胞的外观时，我们将细胞提起并用荧光脂质DiI 作为膜探针或CellTracker TM Green 作为含量探针标记它们。通过荧光显微镜对探针在细胞之间的重新分布进行评分。半融合细胞被鉴定为用内含物和膜探针标记的单核细胞。解释必须由具有融合能力不足细胞的阴性对照系统支持，以说明脂质探针的与融合无关的交换，并将其贡献降到最低。这种方法进行了较小的修改已用于调查原代鼠成肌细胞，破骨细胞前体的融合以及由配子融合原HAP2 介导的融合，并且很可能可以用于其他缓慢的细胞-细胞融合过程。
[Bac kground ...
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| Centromere Chromosome Orientation Fluorescent in situ Hybridization (Cen-CO-FISH) Detects Sister Chromatid Exchange at the Centromere in Human Cells
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Human centromeres are composed of large tandem arrays of repetitive alpha satellite DNA, which are often sites of aberrant rearrangement in cancers (Mitelman et al., 1997; Padilla-Nash et al., 2001). To date, annotation of the human centromere repetitive sequences remains incomplete, greatly hindering in-depth functional studies of these regions essential for chromosome segregation. In order to monitor sister chromatid exchange happening at the centromere (C-SCE) due to recombination and mutagenic events, I have applied the Chromosome-Orientation Fluorescence in situ ...
[摘要] 人类着丝粒由重复的α卫星DNA的大串联阵列组成，这些细胞通常是癌症中异常重排的位点（Mitelman等人，1997; Padilla-Nash等人 >，2001）。迄今为止，对人类着丝粒重复序列的注释仍然不完整，极大地妨碍了这些区域对染色体分离至关重要的深入功能研究。为了监测由于重组和诱变事件而在着丝粒（C-SCE）上发生姊妹染色单体交换，我将染色体定位荧光原位杂交（CO-FISH）技术应用于着丝粒（ Cen-CO-FISH）在人类细胞中的表达。这种基于杂交的方法包括（1）通过单轮复制掺入核苷酸类似物，（2）新合成的DNA链的酶消化和（3）单链探针的后续杂交，在不存在变性步骤的情况下。所产生的信号允许基于DNA的5'-3'方向性差异地标记每个姊妹染色单体，并评估指示C-SCE的异常染色模式。应用于人类着丝粒的Cen-CO-FISH方法揭示，人类着丝粒确实在循环细胞中发生重组，导致C-SCE，并且在经历衰老的癌细胞系和原代细胞中着丝粒不稳定性增强（Giunta和Funabiki，2017）。在这里，我介绍了人类细胞中Cen-CO-FISH方法的制备，实验程序和数据采集的详细方案。它还包括该技术的概念性概述，以及代表性图像和评分准则的示例。 Cen-CO-FISH是促进着丝粒重复探索的有用工具。
【背景】人类基因组计划于2003年标记为完成，但它遗漏了超过10％的人类重复DNA（de ...
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