Measuring Intracellular Vesicle Density and Dispersion Using Fluorescence Microscopy and ImageJ/FIJI
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Author:
Date:
2020-08-05
[Abstract] Cell signalling, cell secretion, and plasma membrane repair are processes that critically rely on intracellular vesicles, important components of the endocytic and secretory pathways. More specifically, the strategic distribution of intracellular vesicles is important for diverse cellular processes. The method presented here is a simple, affordable, and efficient tool to analyze the distribution of intracellular vesicles such as lysosomes, endosomes, Golgi vesicles or secretory granules under different experimental conditions. The method is an accessible way to analyze the density and ...
[摘要] [摘要]细胞信号传导、细胞分泌和质膜修复是严重依赖于细胞内小泡的过程,这些小泡是细胞内吞和分泌途径的重要组成部分。更具体地说,细胞内囊泡的策略性分布对不同的细胞过程非常重要。该方法是一种简单、经济、有效的分析溶酶体、内体、高尔基体或分泌颗粒等细胞内囊泡分布的工具。该方法是通过结合免疫荧光和基于像素的量化软件(例如ImageJ/FIJI)来分析细胞内囊泡的密度和分散度的一种简便方法。该协议可以在科学界广泛使用,因为它利用了ImageJ/FIJI,一个免费的开源软件。通过追踪荧光囊泡相对于细胞核的位置,我们能够量化和分析它们在整个细胞中的分布。
[背景]细胞内小泡是细胞内吞和分泌途径的重要组成部分,负责维持细胞的一些重要功能。因此,许多研究集中在生理和病理条件下调控囊泡分布的途径,而其他研究则探讨了在许多重要的细胞过程中囊泡分布异常的后果。
1988年,Aunis和Bader发现分泌细胞中存在两个分泌小泡池(Aunis和Bader,1988)。第一个小池位于质膜下方,分泌不受细胞骨架的调节,而是由于与细胞骨架中的元素结合而附着在质膜上;第二个池子附着在肌动蛋白细丝上,略远离细胞膜,当第一池耗尽后,可被动员到质膜的内小叶上。这是通过膜的去极化、肌动蛋白丝的重排和细胞骨架屏障的溶解来实现的,从而使其从细胞骨架上脱离,到达胞外部位。 ...
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Quantification of Protein Kinase A (PKA) Activity by An in vitro Radioactive Assay Using the Mouse Sperm Derived Enzyme
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Author:
Date:
2020-06-20
[Abstract] In order to acquire fertilizing potential, mammalian sperm must undergo a process known as capacitation, which relies on the early activation of Protein Kinase A (PKA). Frequently, PKA activity is assessed in whole-cell experiments by analyzing the phosphorylation status of its substrates in a western-blot. This technique faces two main disadvantages: it is not a direct measure of the kinase activity and it is a time-consuming approach. However, since PKA can be readily obtained from sperm extracts, in vitro assays such as the “radioactive assay” can be ...
[摘要] [Abstract]为了获得受精潜能,哺乳动物的精子必须经历一个被称为电容的过程,这个过程依赖于蛋白激酶A(PKA)的早期激活。通常,在全细胞实验中,通过分析其底物在western-blot中的磷酸化状态来评估PKA的活性。这种技术面临着两个主要的缺点:它不是对激酶活性的直接测量,而且是一种耗时的方法。然而,由于PKA可以很容易地从精子提取物中获得,体外检测如"放射性检测"可以使用原生酶进行。与western-blot不同的是,放射性测定法是一种直接的技术,通过将整合的32P定量到肽类底物中来评价PKA的活性。这种方法很容易允许分析PKA的不同激动剂或拮抗剂。由于小鼠精子是可溶性PKA的丰富来源,这种测定法可以进行简单的分馏,使PKA既可用于体外测试药物对PKA活性的影响,也可用于跟踪PKA活性在增容开始时的变化。
[Background] ...
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Identification and Quantitation of Leukocyte Populations in Human Kidney Tissue by Multi-parameter Flow Cytometry
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Author:
Date:
2018-08-20
[Abstract] Inflammatory immune cells play direct pathological roles in cases of acute kidney injury (AKI) and chronic kidney disease (CKD). However, the identification and characterization of distinct populations of leukocytes in human kidney biopsies have been confounded by the limitations of immunohistochemical (IHC)-based techniques used to detect them. This methodology is not amenable to the combinations of multiple markers necessary to unequivocally define discrete immune cell populations. We have developed a multi-parameter, flow cytometric-based approach that addresses the need for panels of ...
[摘要] 炎症性免疫细胞在急性肾损伤(AKI)和慢性肾病(CKD)的病例中发挥直接的病理作用。然而,人肾活组织检查中不同白细胞群的鉴定和表征已被用于检测它们的基于免疫组织化学(IHC)的技术的局限性所混淆。该方法不适用于明确定义离散免疫细胞群所必需的多种标志物的组合。我们开发了一种多参数,基于流式细胞仪的方法,解决了在鉴定免疫细胞群体时需要细胞特异性标记组,从而允许从单个临床肾活检标本中准确检测和定量白细胞亚群。在该方法中,将新鲜的人肾组织解离成单细胞悬浮液,然后进行抗体标记和基于流式细胞术的采集和分析。这种新技术为鉴定和计数人类肾脏疾病中的免疫细胞亚群提供了重大进步,并且是补充临床肾脏活组织检查的传统组织病理学检查的有力平台。
【背景】 肾脏疾病的发病率和患病率正在上升,给全世界的医疗保健社区带来了沉重的负担,并显着影响了患者的生活质量(世界肾脏日:慢性肾病,2015年)。肾脏损害可能由多种损伤引起,包括感染,缺血,毒素,高血压,遗传和代谢紊乱(Imig和Ryan,2013)。对功能性损伤的即时反应是急性肾损伤(AKI),这是一种临床综合征,其特征在于生理上通过肾功能的快速(数小时至数天)降低和组织形态学上通过炎性免疫细胞浸润到肾小管中,组织隔室邻接小管。肾脏(Basile ...
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