| Dual Fluorescence Reporter Based Analytical Flow Cytometry for miRNA Induced Regulation in Mammalian Cells
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Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] MicroRNA-induced gene regulation is a growing field in basic and translational research. Examining this regulation directly in cells is necessary to validate high-throughput data originated from RNA sequencing technologies. For this several studies employ luciferase-based reporters that usually measure the whole cell population, which comes with low resolution for the complexity of the miRNA-induced regulation. Here, we provide a protocol using a dual-fluorescence reporter and flow cytometry reaching single cell resolution; the protocol contains a simplified workflow that includes: vector ...
[摘要] MicroRNA诱导的基因调控是基础和转化研究中不断增长的领域。 直接在细胞中检查该调节对于验证源自RNA测序技术的高通量数据是必要的。 对于这一研究，一些研究采用基于荧光素酶的报告基因，通常测量全细胞群，其具有低分辨率的miRNA诱导调节的复杂性。 在这里，我们提供使用双荧光报告基因和流式细胞仪达到单细胞分辨率的方案; 该协议包含一个简化的工作流程，包括：使用R环境进行矢量生成，数据采集，处理和分析。 我们的协议可实现miRNA诱导的转录后基因调控的高分辨率测量，并结合系统生物学，可用于估计miRNA的熟练程度。
【背景】MicroRNAs（miRNA）是高度保守的小型非蛋白质编码RNA（21-22nt），可调节转录后基因表达并调节基因生物学过程，如发育和细胞稳态（Lagos-Quintana et al。，2001; Fabian et al。，2010; Bartel，2018），包括miRNA表达与肿瘤进展和侵袭性相关的几种病理（Lu et al。， 2005; Di Leva和Croce，2013; Krishnan et al。，2015; Bertoli et ...
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| Isolation of Microvascular Endothelial Cells
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Author:
Date:
2018-06-20
[Abstract] The vascular endothelium is essential to normal vascular homeostasis. Its dysfunction participates in various cardiovascular disorders. Murine endothelial cell culture is an important tool for cardiovascular disease research. This protocol demonstrates a quick, efficient method for the isolation of microvascular endothelial cells from murine tissues without any special equipment. To isolate endothelial cells, the lung or heart were mechanically minced and enzymatically digested with collagenase and trypsin. The single cell suspension obtained was then incubated with an anti-CD31, anti-CD105 ...
[摘要] 血管内皮是正常血管稳态所必需的。其功能障碍参与各种心血管疾病。小鼠内皮细胞培养是心血管疾病研究的重要工具。该协议演示了一种快速，有效的方法从小鼠组织中分离微血管内皮细胞而无需任何特殊设备。为了分离内皮细胞，将肺或心脏机械切碎并用胶原酶和胰蛋白酶进行酶促消化。然后将获得的单细胞悬浮液与抗CD31，抗CD105抗体和生物素化的异凝集素B-4温育。使用大鼠抗小鼠Ig-和链霉亲和素缀合的微珠，使用磁珠分离收获内皮细胞。扩张内皮细胞并收集用于随后的分析。这些培养物的形态和表型特征在培养10代以上保持稳定。在任何阶段没有过度生长的非内皮来源的污染细胞。
【背景】微血管内皮细胞通过调节白细胞再循环和作为T淋巴细胞的抗原呈递细胞而在免疫应答的发展中起中心作用。内皮的良好状态对血管稳态很重要。功能失调的内皮参与各种心血管疾病，包括动脉粥样硬化，血管炎和缺血/再灌注损伤（Cid et al。，2004; Wang等人，2007）。因此，体外培养的内皮细胞培养物是研究血管生理学和疾病病理学的重要工具。然而，分离原代鼠类内皮细胞被认为是特别困难的，因为大多数描述的方案涉及用消化酶灌注器官或大血管和耗时的纯化过程（Gumkowski等人，1987） 。
该协议的目的是提供一种简单的方法，不需要使用任何特殊设备即可从肺/心脏中分离和扩展内皮细胞。使用这种方法，我们以前补充了体内研究，证明了CD31信号传导在内皮细胞细胞保护中的重要性（Cheung等人，2015年）。 ...
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| Assessing Rates of Long-distance Carbon Transport in Arabidopsis by Collecting Phloem Exudations into EDTA Solutions after Photosynthetic Labeling with [14C]CO2
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2017-12-20
[Abstract] Phloem loading and transport of photoassimilate from photoautotrophic source leaves to heterotrophic sink organs are essential physiological processes that help the disparate organs of a plant function as a single, unified organism. We present three protocols we routinely use in combination with each other to assess (1) the relative rates of sucrose (Suc) loading into the phloem vascular system of mature leaves (Yadav et al., 2017a), (2) the relative rates of carbon loading and transport through the phloem (this protocol), and (3) the relative rates of carbon unloading into ...
[摘要] 来自光合自养源的光合同化物的韧皮部装载和运输到异养宿主器官是必不可少的生理过程，其帮助植物的不同器官作为单一的统一生物体起作用。我们提出了三种方案，我们经常使用它们相互结合来评估（1）蔗糖（Suc）加载到成熟叶片的韧皮部血管系统中的相对比率（Yadav等人，2017a）， （2）通过韧皮部的碳载量和转运的相对速率（本方案）;（3）长距离运输后碳向异养池器官，特别是根部卸载的相对速率（Yadav等，我们建议，在实验和对照植物上进行所有三种方案提供了全植物碳分配的可靠比较，并将与单独进行的单个方案相关的模糊度最小化（Dasgupta等人， 2014年;卡迪尔卡尔等人，2016年）。在该方案中，在源叶中光致同化[14C] CO 2 2-，并且通过将韧皮部流出物收集到EDTA溶液中，随后进行闪烁计数来量化光合同化物的韧皮部负载和转运。
【背景】通过韧皮部将光合自养源组织中的还原碳和其他化合物分配到异养池组织是影响植物生长和产量的关键生理过程。由于这一核心作用，有兴趣从植物生物学的许多领域分析和量化韧皮部含量。然而，收集真正的韧皮部汁液是困难的，因为易位流一般在高静水压力下，而且筛分元件具有快速的自密封机制以防止损坏时的损失。几种收集技术已经出现，但目前还没有一种方法或一组方法提供了一个完整的，无伪象的易位韧皮部液位测量方法。在这里，我们简要描述替代技术，然后详细描述我们的方法，收集韧皮部分泌物到含有低浓度乙二胺四乙酸（EDTA）的溶液中，然后用[14 ...
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