| Probe-Seq: Method for RNA Sequencing of Specific Cell Types from Animal Tissue
|
|
Author:
Date:
2020-09-20
[Abstract] Most organs and tissues are composed of many types of cells. To characterize cellular state, various transcription profiling approaches are currently available, including whole-tissue bulk RNA sequencing, single cell RNA sequencing (scRNA-Seq), and cell type-specific RNA sequencing. What is missing in this repertoire is a simple, versatile method for bulk transcriptional profiling of cell types for which cell type-specific genetic markers or antibodies are not readily available. We therefore developed Probe-Seq, which uses hybridization of gene-specific probes to RNA markers for isolation of ...
[摘要] [摘要 ] 大多数器官和组织由许多类型的细胞组成。为了表征细胞状态，目前可以使用各种转录分析方法，包括全组织体RNA测序，单细胞RNA测序（scRNA -Seq）和特定于细胞类型的RNA测序。在此库中缺少的是一种简单，通用的方法，无法批量获得细胞类型的特定基因标记或抗体，因此无法批量转录。因此，我们开发了Probe-Seq，该探针使用基因特异性探针与RNA标记的杂交来分离特定类型的细胞，以实现下游FACS分离和大量RNA测序。我们表明，该方法可以实现从小鼠视网膜，冷冻人视网膜，果蝇中肠和发育中的雏鸡视网膜中分离和分析特定细胞类型的特征，这表明它对大多数生物很有用。
[背景技术 [ 0002 ] 在过去的二十年中，使用RNA-Seq和微阵列进行转录谱分析已在生物学研究中无处不在。分析现在是用来了解大多数生物体中细胞和细胞状态的主要工具之一。它被用于正常发育，异常发育和疾病的研究，并极大地扩展了我们对进化关系的理解。特别地，scRNA- Seq已经以前所未有的速度导致了新型细胞类型的鉴定（Picelli 等，2013；Jaitin 等，2014； Klein 等，2015； Macosko 等，2015）。为了更深入地了解这些新描述的细胞类型，一种无需转基因标记或特异性抗原即可将其分离的方法将大有裨益。尽管可以使用scRNA ...
|
|
|
| A Quantitative Heterokaryon Assay to Measure the Nucleocytoplasmic Shuttling of Proteins
|
|
Author:
Date:
2018-09-05
[Abstract] Many proteins appear exclusively nuclear at steady-state but in fact shuttle continuously back and forth between the nucleus and the cytoplasm. For example, nuclear RNA-binding proteins (RBPs) often accompany mRNAs to the cytoplasm, where they can regulate subcellular localization, translation and/or decay of their cargos before shuttling back to the nucleus. Nucleocytoplasmic shuttling must be tightly regulated, as mislocalization of several RBPs with prion-like domains such as FUS and TDP-43 causes the cytoplasmic accumulation of solid pathological aggregates that have been implicated in ...
[摘要] 许多蛋白质在稳态下仅出现核，但事实上在细胞核和细胞质之间连续地来回穿梭。例如，核RNA结合蛋白（RBP）通常伴随mRNA到达细胞质，在那里它们可以在穿梭回到细胞核之前调节其货物的亚细胞定位，翻译和/或腐烂。必须严格调节核质穿梭，因为几种RBP与朊病毒样结构域如FUS和TDP-43的错误定位导致固体病理性聚集体的细胞质积累，这些聚集体与肌萎缩侧索硬化症（ALS）和额颞叶痴呆等神经退行性疾病有关。 （FTD）。传统上，种间异核体分析已被用于确定感兴趣的核蛋白是否穿梭;这些分析是基于来自两个不同物种（例如，小鼠和人类）的供体和受体细胞之间的融合，可以根据不同的染色质染色模式区分，并检测蛋白质的外观。受体核。然而，异核体的鉴定需要经验并且容易出错，这使得难以获得用于定量研究的高质量数据。此外，荧光标记的RBP在供体细胞中的瞬时过表达通常导致其异常的亚细胞定位。在这里，我们提出定量测定，其中表达接近生理水平的eGFP标记的RBP的稳定供体细胞系与表达膜标记物CAAX-mCherry的受体细胞融合，允许容易地鉴定和成像大量高可信度异核体。我们的测定法可用于测量任何感兴趣的核蛋白在不同细胞类型，不同细胞条件下或突变蛋白之间的穿梭活性。
【背景】要了解蛋白质的各种功能，重要的是找出它在细胞内定位的位置。标准的微观和生物化学方法仅在其稳态浓度高于检测阈值时才揭示蛋白质的存在。他们不排除它在短暂地定位的情况下扮演其他重要角色的可能性（Gama-Carvalho和Carmo-Fonseca，2001）。例如，许多RBP在不同的细胞区室中发挥作用，它们伴随着它们的结合mRNA（通常未检测到）并连接真核基因表达的多个步骤（Müller-McNicoll和Neugebauer，2013）。 ...
|
|
|
| Primary Cultures from Human GH-secreting or Clinically Non-functioning Pituitary Adenomas
|
|
Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Pituitary adenomas are among the more frequent intracranial tumors usually treated with both surgical and pharmacological–based on somatostatin and dopamine agonists–approaches. Although mostly benign tumors, the occurrence of invasive behaviors is often detected resulting in poorer prognosis. The use of primary cultures from human pituitary adenomas represented a significant advancement in the knowledge of the mechanisms of their development and in the definition of the determinants of their pharmacological sensitivity. Moreover, recent studies identified also in pituitary adenomas putative ...
[摘要] 垂体腺瘤是更常见的颅内肿瘤之一，通常用基于生长抑素和多巴胺激动剂手术的手术和药物治疗。 虽然多为良性肿瘤，但侵入性行为的发生常常被检测到，导致预后较差。 来自人类垂体腺瘤的原代培养物的使用代表了对其发育机制的知识以及其药理敏感性决定因素的定义方面的显着进步。 此外，最近的研究也在垂体腺瘤中发现了假定的肿瘤干细胞，根据目前的假设，它代表了根除大多数恶性肿瘤的真实细胞靶标。 在这个协议中，我们描述了从人垂体腺瘤建立原代培养的程序，以及如何选择，体外扩增和表型鉴定推定的垂体腺瘤干细胞。
【背景】垂体腺瘤是最常见的颅内肿瘤之一（高达15％），横断面研究发现每100,000名居民中约有90例发病，其中绝大多数为30岁以上的成年人。大约10％的未经选择的垂体在尸检时进行了检查（即考虑到之前未诊断为垂体疾病的受试者的垂体）（ ，Molitch，2017）。尽管通常为良性肿瘤，但垂体腺瘤的处理可因与激素分泌过多相关的临床综合征或发展以治疗抗性，高增殖率，快速复发和绒毛外侵袭为特征的侵袭行为而复杂化（Carreno等人，2017）。成年垂体干细胞的持续存在（Florio，2011）导致垂体腺瘤（以及可能的其他良性瘤形成）的发展可以源自具有干细胞特性（主要是自我更新和分化）的肿瘤细胞的亚群能力），正如已经建立的恶性固体和血液肿瘤一样。
最近的实验证据表明，癌症干细胞（CSC）范例也适用于人和小鼠垂体腺瘤（Donangelo等人，2014; ...
|
|
|