| NP-40 Fractionation and Nucleic Acid Extraction in Mammalian Cells
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Author:
Date:
2017-10-20
[Abstract] This technique allows for efficient, highly purified cytoplasmic and nuclear-associated compartment fractionation utilizing NP-40 detergent in mammalian cells. The nuclear membrane is not disturbed during the fractionation thus leaving all nuclear and perinuclear associated components in the nuclear fraction. This protocol has been modified from Sambrook and Russell (2001) in order to downscale the amount of cells needed. To determine the efficiency of fractionation, we recommend using qPCR to compare the subcellular compartments that have been purified with equivalent amount of control whole ...
[摘要] 该技术允许在哺乳动物细胞中利用NP-40洗涤剂进行高效，高度纯化的细胞质和核相关的分室分离。 在分离过程中核膜不受干扰，从而使核部分中的所有核和核周相关成分留下。 该协议已经从Sambrook和Russell（2001）修改，以便缩减所需的细胞数量。 为了确定分馏的效率，我们建议使用qPCR来比较已经用等量的对照全细胞提取物纯化的亚细胞室。
【背景】为了充分获得对细胞过程的理解，需要分离核和细胞质隔室。 有许多协议，甚至一些商业套件可用于帮助分离两个隔间。 然而，大多数需要高离心速度，产量差异甚至验证最终产品中的污染物量的方法也是很高的。 我们的协议在低速下使用小型台式离心机，以获得高纯度的细胞质提取物和核/核周组合相关隔室，以及数据分析，以验证污染物的百分比。 迄今为止，已经测试的细胞系是293T，HeLa和GHOST细胞系。 （Galvis，2014; Galvis等，，2014）。
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| Analysis of Replicative Intermediates of Adeno-associated Virus through Hirt Extraction and Southern Blotting
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Author:
Date:
2017-05-05
[Abstract] Adeno-associated virus (AAV) is a small single-stranded DNA virus that requires the presence of a helper virus, such as adenovirus or herpes virus, to efficiently replicate its genome. AAV DNA is replicated by a rolling-hairpin mechanism (Ward, 2006), and during replication several DNA intermediates can be detected. This detailed protocol describes how to analyze the AAV DNA intermediates formed during AAV replication using a modified Hirt extract (Hirt, 1967) procedure and Southern blotting (Southern, 1975).
[摘要] 腺相关病毒（AAV）是一种小型单链DNA病毒，需要存在辅助病毒，如腺病毒或疱疹病毒，以有效地复制其基因组。 AAV DNA通过滚转发夹机制（Ward，2006）进行复制，并且在复制期间可以检测出几种DNA中间体。该详细方案描述了如何使用改良的Hirt提取物（Hirt，1967）程序和Southern印迹（Southern，1975）分析在AAV复制期间形成的AAV DNA中间体。
背景 AAV DNA复制通过滚动发夹机制在由AAV和辅助病毒如腺病毒或疱疹病毒共感染的细胞中进行（Ward，2006）。 AAV DNA由4.7kb的线性DNA分子和倒置的末端重复（ITR）组成，折叠形成T形发夹结构。 3'末端发夹作为AAV DNA复制的引物。这些发夹结构由AAV Rep蛋白再生，允许进一步复制（Im和Muzyczka，1990）。 AAV DNA的+和 - 链都被包装并且是感染性的（Rose等人，1969）。当分析复制AAV DNA时，可以检测到几种复制中间体（Straus等人，1976）。最丰富的复制中间体是由AAV DNA的一个和一个链形成的线性单体双链体分子，其被认为是将包装在预先形成的衣壳中的后代单链分子的直接前体（Straus ，1976）。二聚体复制中间体也是常见的，AAV复制模型与甚至更大的复制中间体相容。 ...
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| Micro-chromatin Immunoprecipation (μChIP) Protocol for Real-time PCR Analysis of a Limited Amount of Cells
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Author:
Date:
2016-06-20
[Abstract] Chromatin immunoprecipitation followed by deep sequencing (ChIP-Seq) is an important strategy to study gene regulation. When availability of cells is limited, however, it can be useful to focus on specific genes to investigate in depth the role of transcription factors or histone marks. Unfortunately, performing ChIP experiments to study transcription factors’ binding to DNA can be difficult when biological material is restricted. This protocol describes a robust method to perform μChIP for over-expressed or endogenous transcription factors using ~100,000 cells per ChIP experiment ...
[摘要] 染色质免疫沉淀后深层测序（ChIP-Seq）是研究基因调控的重要策略。 然而，当细胞的可用性有限时，可能有用的是专注于特定的基因深入研究转录因子或组蛋白标记的作用。 不幸的是，当生物材料受到限制时，进行ChIP实验以研究转录因子与DNA的结合可能是困难的。 该方案描述了使用约100,000个细胞/ChIP实验对过表达或内源性转录因子进行μChIP的稳健方法（Masserdotti等人，2015）。 我们还描述了优化步骤，我们认为这是协议工作的关键，可以用于进一步减少单元格的数量。
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