| Preserve Cultured Cell Cytonemes through a Modified Electron Microscopy Fixation
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] Immunocytochemistry of cultured cells is a common and effective technique for determining compositions and localizations of proteins within cellular structures. However, traditional cultured cell fixation and staining protocols are not effective in preserving cultured cell cytonemes, long specialized filopodia that are dedicated to morphogen transport. As a result, limited mechanistic interrogation has been performed to assess their regulation. We developed a fixation protocol for cultured cells that preserves cytonemes, which allows for immunofluorescent analysis of endogenous and ...
[摘要] 培养细胞的免疫细胞化学是用于确定细胞结构内蛋白质的组成和定位的常用且有效的技术。 然而，传统的培养细胞固定和染色方案不能有效地保存培养的细胞色素，长期专门用于形态发生转运的丝状伪足。 结果，进行了有限的机械审讯以评估其监管。 我们开发了一种用于培养细胞的固定方案，该方案保留了细胞质，允许对内源性和过表达的蛋白质进行免疫荧光分析，这些蛋白质定位于脆弱的细胞结构。
【背景】Cytonemes被分类为薄的（~200nm直径）基于肌动蛋白的丝状伪足，长度超过2μm，可以转运形态发生素（Ramírez-Weber和Kornberg，1999）。这些信号结构首先在发育中的 Drosophila 翼成像盘中进行了详细分类和描述，随后在小鼠，小鸡和斑马鱼模型生物中进行了观察（Ramírez-Weber和Kornberg，1999; Sanders et al。，2013; Stanganello et al。，2015）。在大多数情况下，只有对过表达的荧光标记蛋白进行实时成像才能进行细胞色素检测。由于传统的固定方案未能保存这些脆弱的细丝，因此对培养细胞的细胞色素的检查受到限制。这些并发症一直是决定在发育和组织稳态期间驱动细胞色素形成和功能的细胞机制以及确定这些过程是否在疾病中被破坏的限制因素。
为了克服这些限制，我们开发了一种基于修饰电子显微镜固定剂（MEM-fix）的方案，该方案可以保留培养细胞的细胞质。 ...
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| Sebinger Culture: A System Optimized for Morphological Maturation and Imaging of Cultured Mouse Metanephric Primordia
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Author:
Date:
2018-02-20
[Abstract] Here, we present a detailed protocol on setting up embryonic renal organ cultures using a culture method that we have optimised for anatomical maturation and imaging. Our culture method places kidney rudiments on glass in a thin film of medium, which results in very flat cultures with all tubules in the same image plane. For reasons not yet understood, this technique results in improved renal maturation compared to traditional techniques. Typically, this protocol will result in an organ formed with distinct cortical and medullary regions as well as elongated, correctly positioned loops of ...
[摘要] 在这里，我们提出了一个详细的协议，建立胚胎肾脏器官培养使用培养方法，我们已经优化解剖成熟和成像。 我们的培养方法是将肾脏的基质放在玻璃上，形成一层薄薄的培养基，培养的平面非常平坦，所有的肾小管都在同一图像平面上。 由于尚未理解的原因，与传统技术相比，该技术导致肾成熟的改善。 通常情况下，这个协议将导致器官形成不同的皮层和髓质区域，以及拉长，正确定位的亨利循环。 本文介绍了我们的方法并提供了详细的建议。 我们已经在Sebinger等人（2010）和Chang和Davies（2012）上发表了关于该技术性能的定性和定量评估。
【背景】哺乳动物的后肾（永久性）肾发育于位于中胚层尾端的简单遗传。在小鼠胚胎日（'E'）10，这些基因形成并由两种形态上可区分的组分组成;产生为Wolffian（肾）导管的憩室的上皮性输尿管芽，以及形成在导管旁的后肾间质（metanephrogenic mesenchyme）。随着发育进展，输尿管芽进入后肾间质，经历多轮生长和分枝，形成“树”。这后来重塑以产生一个成熟的集合管系统，其中肾小管从中心腔，肾盂放射（Lindstrom等人，2015）。肾盂排水到输尿管，从输尿管芽的原始茎形成。随着输尿管芽发育，它诱导来自后肾间充质细胞的细胞在其每个尖端周围凝结形成“帽间充质”（Schreiner，1902; ...
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