| Polyamine Transport Assay Using Reconstituted Yeast Membranes
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Author:
Date:
2021-01-20
[Abstract] ATP13A2/PARK9 is a late endo-/lysosomal P5B transport ATPase that is associated with several neurodegenerative disorders. We recently characterized ATP13A2 as a lysosomal polyamine exporter, which sheds light on the molecular identity of the unknown mammalian polyamine transport system. Here, we describe step by step a protocol to measure radiolabeled polyamine transport in reconstituted vesicles from yeast cells overexpressing human ATP13A2. This protocol was developed as part of our recent publication (van Veen et al., 2020) and will be useful for characterizing the transport function of ...
[摘要] [摘要] ATP13A2 / PARK9是一种晚期内/溶酶体P5B转运ATPase，与多种神经退行性疾病有关。我们最近将ATP13A2表征为溶酶体多胺出口者，这为未知的哺乳动物多胺转运系统的分子身份提供了线索。在这里，我们逐步描述了从过量表达人ATP13A2的酵母细胞中测量重组囊泡中放射性标记的多胺转运的方案。该方案是我们最新出版物的一部分（van Veen等，2020），将有助于表征其他假定的多胺转运蛋白的转运功能，例如P5B转运ATPase的同工型。
[背景] ATP13A2 / PARK9编码一种普遍表达的晚期内-/溶酶体膜蛋白，与一系列神经退行性疾病有关，例如早发性帕金森氏病（Di Fonzo等，2007 ；Lin等，2008）和Kufor -Rakeb综合征（伴痴呆的早期帕金森病）（Ramirez等，2006 ；Park等，2011）。ATP13A2属于P型转运ATPase ，是一类活性转运蛋白，由于ATP水解而暂时形成磷酸中间产物（Kuhlbrandt ，2004年）。ATP13A2是P5亚家族的成员，该家族已在20多年前通过基因组测序鉴定出来（Axelsen和Palmgren ...
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| Probe-Seq: Method for RNA Sequencing of Specific Cell Types from Animal Tissue
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Date:
2020-09-20
[Abstract] Most organs and tissues are composed of many types of cells. To characterize cellular state, various transcription profiling approaches are currently available, including whole-tissue bulk RNA sequencing, single cell RNA sequencing (scRNA-Seq), and cell type-specific RNA sequencing. What is missing in this repertoire is a simple, versatile method for bulk transcriptional profiling of cell types for which cell type-specific genetic markers or antibodies are not readily available. We therefore developed Probe-Seq, which uses hybridization of gene-specific probes to RNA markers for isolation of ...
[摘要] [摘要 ] 大多数器官和组织由许多类型的细胞组成。为了表征细胞状态，目前可以使用各种转录分析方法，包括全组织体RNA测序，单细胞RNA测序（scRNA -Seq）和特定于细胞类型的RNA测序。在此库中缺少的是一种简单，通用的方法，无法批量获得细胞类型的特定基因标记或抗体，因此无法批量转录。因此，我们开发了Probe-Seq，该探针使用基因特异性探针与RNA标记的杂交来分离特定类型的细胞，以实现下游FACS分离和大量RNA测序。我们表明，该方法可以实现从小鼠视网膜，冷冻人视网膜，果蝇中肠和发育中的雏鸡视网膜中分离和分析特定细胞类型的特征，这表明它对大多数生物很有用。
[背景技术 [ 0002 ] 在过去的二十年中，使用RNA-Seq和微阵列进行转录谱分析已在生物学研究中无处不在。分析现在是用来了解大多数生物体中细胞和细胞状态的主要工具之一。它被用于正常发育，异常发育和疾病的研究，并极大地扩展了我们对进化关系的理解。特别地，scRNA- Seq已经以前所未有的速度导致了新型细胞类型的鉴定（Picelli 等，2013；Jaitin 等，2014； Klein 等，2015； Macosko 等，2015）。为了更深入地了解这些新描述的细胞类型，一种无需转基因标记或特异性抗原即可将其分离的方法将大有裨益。尽管可以使用scRNA ...
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| In situ Hybridization (ISH) in Preparasitic and Parasitic Stages of the Plant-parasitic Nematode Meloidogyne spp.
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Author:
Date:
2018-03-20
[Abstract] The spatio-temporal expression pattern of a gene provides important indications to better understand its biological function. In situ hybridization (ISH) uses a labeled complementary single-stranded RNA or DNA probe to localize gene transcripts in a whole organism, a whole organ or a section of tissue. We adapted the ISH technique to the plant parasite Meloidogyne spp. (root-knot nematode) to visualize RNAs both in free-living preparasitic juveniles and in parasitic stages settled in the plant tissues. We describe each step of the probe synthesis, digoxigenin (DIG) labeling, ...
[摘要] 基因的时空表达模式为更好地理解其生物学功能提供了重要的指示。 原位杂交（ISH）使用标记的互补单链RNA或DNA探针来定位整个生物体，整个器官或一部分组织中的基因转录物。 我们将ISH技术应用于植物寄生虫
【背景】到目前为止，植物寄生性线虫的稳定转化尚未成功。 ISH能够在整个装载的Meloidogyne spp中分析体内时空基因表达。线虫。这些根结线虫在土壤中以微小蚓状幼虫（J2）形式孵化并感染宿主植物根部。 J2s穿透根部并迁移到根部维管柱状细胞。幼虫定居在根部，发育成J3和J4寄生幼鱼，诱导分化专化饲养细胞。线虫最终发育成梨形雌性，将在根表面释放数百个卵。在这里，我们报告了一个详细的协议来检测准备性整体安装J2s和寄生阶段中的单个RNA分子。寄生虫阶段的ISH需要在感染根部提取线虫前一天采取额外的程序。我们描述了在线虫整个组织中使用地高辛（DIG）标记的cDNA探针检测转录物。
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