| In vitro Enzymatic Assays of Histone Decrotonylation on Recombinant Histones
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Author:
Date:
2018-07-20
[Abstract] Class I histone deacetylases (HDACs) are efficient histone decrotonylases, broadening the enzymatic spectrum of these important (epi-)genome regulators and drug targets. Here, we describe an in vitro approach to assaying class I HDACs with different acyl-histone substrates, including crotonylated histones and expand this to examine the effect of inhibitors and estimate kinetic constants.
[摘要] I类组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是有效的组蛋白去蛋白酶，拓宽了这些重要（epi-）基因组调节因子和药物靶标的酶谱。 在这里，我们描述了一种体外方法来测定具有不同酰基 - 组蛋白底物的I类HDAC，包括巴豆酰化组蛋白，并将其扩展以检查抑制剂的作用并估计动力学常数。
【背景】组蛋白的翻译后修饰是基因组调控的重要方面，包括基因表达（例如参见Pengelly et al。，2013;在Castillo 等人中综述，2017）。组蛋白修饰改变染色质结构和/或调节蛋白质的结合，例如核小体重塑因子（在Bannister和Kouzarides，2011中综述）。大多数组蛋白修饰是可逆的并且可以酶促去除。例如，通过组蛋白脱乙酰基酶（HDAC）除去组蛋白乙酰化，其中存在几类。近年来，新的组蛋白赖氨酸酰化，包括琥珀酰化，丙酰化，丁酰化，羟基丁基化和巴豆酰化已成为规范组蛋白乙酰化的新替代物，并且已经证实了许多这些新发现的组蛋白修饰的功能相关性（Sabari 等人，2017）。特别是，组蛋白巴豆酰化与活性基因表达有关，并被认为受细胞代谢状态的影响（Sabari et al。，2015; Fellows et al。 ，2018年）。最近已显示I类组蛋白脱乙酰酶也有效地去除组蛋白质（Wei et al。，2017; Fellows et al。，2018）。
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| RNA Immunoprecipitation (RIP) Sequencing of Pri-miRNAs Associated with the Dicing Complex in Arabidopsis
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Author:
Date:
2018-07-05
[Abstract] RNA immunoprecipitation (RIP) is an antibody-based technique used to map in vivo RNA-protein interactions. DBR1, an RNA debranching enzyme, is responsible for the debranching of lariat RNA, for the degradation and turnover of lariat RNAs. It is well known that primary miRNA (Pri-miRNA) is recognized and further processed into mature miRNA by the Dicing complex mainly composed of DCL1 and HYL1. Due to the low abundance of pri-miRNAs, RIP followed qRT-PCR has been widely used to evaluate the binding efficiency of the Dicing complex with pri-miRNAs in previous studies. Therefore, the ...
[摘要] RNA免疫沉淀（RIP）是一种基于抗体的技术，用于绘制体内 RNA-蛋白质相互作用。 DBR1是一种RNA脱支酶，负责套索RNA的脱支，用于套索RNA的降解和转换。众所周知，主要miRNA（Pri-miRNA）被主要由DCL1和HYL1组成的切割复合物识别并进一步加工成成熟miRNA。由于pri-miRNA的丰度较低，RIP随后的qRT-PCR已被广泛用于评估切割复合物与pri-miRNA在先前研究中的结合效率。因此，缺乏对具有pri-miRNA的切割复合物的全基因组评估。随着高通量测序技术的改进，我们成功地使用RIP-seq比较了Dicing复合物与野生型和 dbr1-2 突变体之间的pri-miRNA的结合效率。 。在该方案中，我们提供了在两种不同基因型之间的HYL1-YFP和DCL1-YFP转基因植物中使用GFP捕获珠的RIP-seq的详细描述。该方法可用于评估pri-miRNA与拟南芥中的切割复合物的结合，并且它可以应用于植物中的其他RNA结合蛋白。
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| Centromere Chromosome Orientation Fluorescent in situ Hybridization (Cen-CO-FISH) Detects Sister Chromatid Exchange at the Centromere in Human Cells
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Author:
Date:
2018-04-05
[Abstract] Human centromeres are composed of large tandem arrays of repetitive alpha satellite DNA, which are often sites of aberrant rearrangement in cancers (Mitelman et al., 1997; Padilla-Nash et al., 2001). To date, annotation of the human centromere repetitive sequences remains incomplete, greatly hindering in-depth functional studies of these regions essential for chromosome segregation. In order to monitor sister chromatid exchange happening at the centromere (C-SCE) due to recombination and mutagenic events, I have applied the Chromosome-Orientation Fluorescence in situ ...
[摘要] 人类着丝粒由重复的α卫星DNA的大串联阵列组成，这些细胞通常是癌症中异常重排的位点（Mitelman等人，1997; Padilla-Nash等人 >，2001）。迄今为止，对人类着丝粒重复序列的注释仍然不完整，极大地妨碍了这些区域对染色体分离至关重要的深入功能研究。为了监测由于重组和诱变事件而在着丝粒（C-SCE）上发生姊妹染色单体交换，我将染色体定位荧光原位杂交（CO-FISH）技术应用于着丝粒（ Cen-CO-FISH）在人类细胞中的表达。这种基于杂交的方法包括（1）通过单轮复制掺入核苷酸类似物，（2）新合成的DNA链的酶消化和（3）单链探针的后续杂交，在不存在变性步骤的情况下。所产生的信号允许基于DNA的5'-3'方向性差异地标记每个姊妹染色单体，并评估指示C-SCE的异常染色模式。应用于人类着丝粒的Cen-CO-FISH方法揭示，人类着丝粒确实在循环细胞中发生重组，导致C-SCE，并且在经历衰老的癌细胞系和原代细胞中着丝粒不稳定性增强（Giunta和Funabiki，2017）。在这里，我介绍了人类细胞中Cen-CO-FISH方法的制备，实验程序和数据采集的详细方案。它还包括该技术的概念性概述，以及代表性图像和评分准则的示例。 Cen-CO-FISH是促进着丝粒重复探索的有用工具。
【背景】人类基因组计划于2003年标记为完成，但它遗漏了超过10％的人类重复DNA（de ...
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